青绿苔草(Care breviculmis)愈伤组织诱导与再生体系的建立

位明君, 王 萌, 范希峰, 滕文军, 滕 珂, 温海峰, 武菊英, 刘艳芬, 岳跃森*

(1.北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所/农业农村部华北都市农业重点实验室， 北京， 100097；2.河北工程大学园林与生态工程学院， 邯郸， 056000； 3.北京农学院植物科学技术学院， 北京， 102206)

青绿苔草(C.breviculmis)为莎草科(Cyperaceae)苔草属(CarexL.)多年生草本，紧凑丛生，株高10～30 cm，叶片为浅绿色线形[1]。因其具有耐阴、生长季长、形态优美和抗逆性强等特点，广泛应用于地表种植和园林绿化，以起到覆盖地表、保持水土的作用。

苔草属植物具有较强的生态适应性，对恢复与改善生态环境具有重要作用[2-3]。刘凌云等[4-5]在综述中针对苔草属植物遗传多样性在物种起源及亲缘关系、遗传图谱构建、品种选育和鉴定等方面详细归纳，为苔草的进一步开发应用提供了理论基础。梁芳等[6-8]发现苔草种子存在不同程度的休眠现象，其中麻根苔草(C.arnellii)、异鳞苔草(C.heterolepis)、溪水苔草(C.forficula)发芽极其困难[6]。李慧等[9]针对青绿苔草的休眠问题，分别采用渗调引发、激素引发、水引发和混合处理的方法对其种子进行处理，处理后种子的发芽势和发芽指数得到提高，发芽时间缩短，发芽率提高4%。

组织培养技术被广泛应用于生物学[10]、园艺学[11-12]等研究领域中，解决了种子发芽困难、实生苗弱以及分株繁殖受季节限制的问题[13]。吕秀立等[14-15]分别以靠近根系部分的生长点为外植体，通过添加植物激素诱导不定芽的方法，建立金叶苔草(C.oshimensis'Evergold')快繁体系，但同时也提出了外植体消毒困难的问题；亓杰等[16-17]均以种子为外植体，分别通过诱导种子萌发后进行芽增殖，和诱导愈伤的方法建立了异麟苔草和青藏苔草(C.moorcroftii)的再生体系；然而，有关青绿苔草再生体系的研究尚未见报道。由于种子容易储存、且不受季节限制，因此本研究以青绿苔草种子为试验材料，通过诱导愈伤组织的方式建立青绿苔草再生体系，为研究青绿苔草的遗传转化及应用生物技术育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为国审品种‘四季’青绿苔草(C.breviculmis‘siji’)种子，来源于北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所。

1.2 试验方法

1.2.1外植体的消毒 挑选饱满的种子，用无菌水清洗1遍，在超净工作台中用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗干净后，用0.1%的氯化汞浸泡消毒20 min，无菌水冲洗3～5次后放到无菌纸上，吸干水分后接种到培养基中。

1.2.2愈伤诱导培养基的筛选 在Murashige and Skoog培养基(以下简称MS)的基础上添加不同浓度的NAA(0.5，1.0，1.5 mg·L-1)、6-BA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)和2,4-D(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)，利用正交试验设计，采用9种组合作为愈伤诱导培养基。每种培养基中接种20粒种子，5个重复，(25±1)℃黑暗条件下诱导愈伤。

表1 L9(33)正交实验表Table 1 L9(33) Orthogonal experiment table

1.2.3不定芽分化培养基的筛选 在MS培养基上添加不同配比的NAA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)、6-BA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)做完全随机试验，共设计9种培养基。在保证愈伤长势一致，大小均等的情况下，每种培养基接种9块愈伤，做4个重复，在温度24±1℃、光照16 h、黑暗8 h条件下培养，4 w后统计分化情况。

1.2.4生根培养基的筛选 在1/2 MS培养基上添加不同浓度IBA(0.05，0.10，0.20 mg·L-1)、NAA(0.10，0.20 mg·L-1)，促进其生根，将长势一致的不定芽接种到生根培养基中，每瓶接种4个，做4个重复，培养条件同不定芽分化培养，3 w后统计其生根情况。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 25.0与Excel 2010进行数据的统计与分析。

2 结果与分析

2.1 不同植物激素对青绿苔草愈伤诱导的影响

将种子种在培养基中10 d左右时，种子的发芽数量超过50%；20 d时，已发芽和未发芽的种子均开始出现愈伤。结果表明，各处理下均成功诱导出愈伤组织，但不同植物激素对青绿苔草愈伤组织的诱导具有显著差异。其中7号培养基愈伤诱导率最高，为68.3%，是1号培养基诱导率的近6倍，愈伤表现为黄色颗粒状；其次为5号、9号培养基，愈伤的诱导率都达到50%以上，其中1号、8号培养基效果最差，诱导率分别为11.7%和15.0%。经统计与分析，诱导愈伤组织时不同植物激素间的主次关系为2,4-D>6-BA>NAA，水平优选后得出理论最佳激素组合为MS+1.5 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D。

表2 不同植物激素对愈伤诱导的影响Table 2 Effects of different plant hormones on callus induction

2.2 不同植物激素对愈伤分化的影响

诱导的愈伤组织经过2～3次继代培养进行增殖，然后转接至分化培养基中，在分化培养基中培养10 d后，愈伤开始增大并出现绿色芽点；继续培养至20 d时，芽点生长为不定芽，并有部分不定芽开始伸长；继续分化至第4 w时，愈伤基本分化完全。不同配比的植物激素对愈伤分化具有显著差异性(表3)，5号培养基分化率为93.8%，分化出不定芽数量最高为40个，不定芽数量是9号培养基的近两倍，不定芽颜色浓绿，长势良好。其次是处理8、处理2，愈伤分化率都在90%以上，但分化出的不定芽数量显著低于处理5。因此确定在基本培养基中添加1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA为最佳分化培养基。

表3 不同植物激素对愈伤分化的影响Table 3 Effects of different plant hormones on callus differentiation

2.3 不同植物激素对不定芽生根的影响

在诱导青绿苔草不定芽生根的过程中，NAA对青绿苔草不定芽生根的影响无显著差异。随着培养基中IBA浓度的增加，处理5、6的生根状况明显差于处理4。当IBA浓度为0.05 mg·L-1时，生根数量和株高与CK培养基无显著差异，但根长只有2.2 cm；当IBA浓度为0.2 mg·L-1时，生根效果较差，根长均不超过1 cm。因此在不添加任何激素的对照(1/2 MS)培养基中，生根效果最好，根长5.17 cm、株高可达到5.20 cm，生根4.33条，显著高于其他处理(表4)。

表4 不同植物激素对不定芽生根的影响Table 4 Effects of different plant hormones on rooting of adventitious shoots

2.4 炼苗移栽

将再生苗瓶口的封口膜打开，炼苗3 d后，将完整的再生植株取出，将根系上的培养基清理干净后移栽到穴盘中，穴盘中的基质浇透水，每天喷一次水，10 d后统计成活率。移栽后的再生苗颜色翠绿，长势良好，成活率可以达到90%(图1)。

图1 青绿苔草再生体系的建立Fig.1 Establishment of C.breviculmis regeneration system注：A愈伤组织的诱导(MS+1.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2,4-D，3w)；B愈伤继代增殖(MS+1.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2,4-D，3w)；C愈伤分化不定芽(MS+ 1.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 6-BA，2w)；D生根培养(1/2MS，2w)Note：A:Induction of callus;B:Callus proliferation;C:Callus differentiation;D:Rooting culture

3 讨论

获得再生植株是遗传学和育种工作的重要基础。由于植物细胞的全能性，试验材料的选择范围也较为广泛，植物的种子、茎段、叶片、花瓣等均可作为外植体。赵娇阳等[18]以偏关苜蓿的种子培养至发芽后，切取子叶及下胚轴诱导愈伤，发现下胚轴诱导愈伤的效果优于子叶；康红霞等[19]发现选择无菌苗的上、下胚轴、真叶均可以诱导愈伤，李孟悦等[20]以毛报春的腋芽为外植体，通过诱导愈伤组织的方法建立了高效的再生体系；徐春波等[21-22]则以冰草幼穗和菊花花瓣为外植体诱导出愈伤组织；狼尾草[23]、金叶苔草[14-15]可选择具有生长点的腋芽和茎尖，通过诱导芽增殖的方法建立植物的快繁体系；花药培养[24]和小孢子培养[25-26]技术在水稻、小麦和蔬菜等植物上也已经较为成熟。在外植体的选择上，叶片、幼穗和花瓣等材料均需要在植物的不同生长时期采取，而种子具有采收后耐储存，消毒方便的特点，本研究以青绿苔草的种子为外植体，建立了其完整的再生体系，可在短时间内获得大量的优质再生植株，为青绿苔草的遗传转化奠定了基础。

在建立青绿苔草再生体系过程中，能否得到高质量的胚性愈伤是至关重要的一步，而植物激素的选择显得尤为重要，不同激素对于不同植物愈伤诱导率具有显著影响。在MS基本培养基中添加2,4-D的效果优于NAA，合适配比的6-BA可以提高愈伤的质量[27-28]；Songstao[29]发现2,4-D和6-BA两种植物激素搭配对于愈伤组织诱导具有很好的效果。王晓璐等[30]以谷子(Setaritalica)种子为外植体，在MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA培养基中，愈伤组织诱导率可达92.9%；柴乖强等[31]提出，6-BA对柳枝稷(Phalarisarundinacea)幼穗诱导愈伤具有明显的促进作用，在浓度为3.0 mg·L-1时到达高峰，随着6-BA浓度的逐渐升高，愈伤诱导率呈减弱趋势。本研究在MS培养基的基础上添加1.5 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-16-BA和2.0 mg·L-12,4-D时，青绿苔草种子的愈伤诱导率最高。

除外植体和植物激素的选择外，基本培养基的选择也较为重要。刘蓉等[32]发现，WPM基本培养基比MS更适于牡丹(Paeoniaostii)幼胚再生，在诱导麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)愈伤组织的研究中，则是以M8为基本培养基[33]；Jakubeková等[27]利用玉米(Zeamays)胚乳，以N6为基本培养基诱导愈伤组织；同样诱导玉米愈伤的研究中，廖长见等[34]则以幼胚为外植体，在N6培养基的基础上添加2.0 mg·L-12,4-D、500 mg·L-1酸水解酪蛋白和38 g·L-1L-脯氨酸，愈伤诱导率达到71%。而各类基本培养基之间主要是大量、微量元素，铁盐和肌醇等物质含量不同，因此，基本培养基的选择对诱导愈伤组织也较为重要。

4 结论

本研究通过添加不同配比的植物激素，以种子为外植体诱导出愈伤组织，培养再生植株，表明青绿苔草种子诱导愈伤的最佳培养基配方为MS+1.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D，最佳不定芽分化培养基为MS+ 1.0 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA，在1/2 MS培养基中生根效果最好，生根培养3 w后将再生苗进行炼苗后移栽至穴盘中，成活率可达90%以上。