反刍动物外植体的研究进展

王秋菊，任雨龙，魏 笑，张 昊，孙 愉，高炳南 (黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319)

在反刍动物的养殖生产过程中，经常会出现营养代谢紊乱导致的生产性能下降等问题[1]。因此，如何能够在保证经济效益的前提下，安全高效的解决养殖过程中出现的问题，提高反刍动物生产性能，成为了很多学者颇为关注的内容[2]。

按照学科领域的划分，外植体有以下两个定义。在细胞生物学中，外植体是指：在植物组织培养和继代培养中，作为离体培养材料的器官或组织片段[3];而在生态学中将其定义为：把一些生物体移植到人工控制条件下，以观测它们在环境变化时的反应，此生物体即为外植体[4]。本文主要就生态学定义的有关反刍动物外植体的研究进行综述，希望能够为反刍动物营养代谢的研究提供新的思路和帮助。

1 外植体在试验研究中的应用

近年来，反刍动物一直是国内外学者研究的热门对象。但多数反刍动物的价格昂贵，样本采集困难，而外植体能够代替活体动物机体内的某些反应机制，并且成本低、易采集，成为了很多学者的优先选择[5-7]。然而，由于反刍动物外植体培养技术出现的时间较晚，部分外植体的培养体系尚不完善，国内外有关外植体培养的报道还比较少。

目前，反刍动物外植体的研究对象主要集中于牛，羊等家畜[8-9]，奶牛，绵羊的子宫内膜，肠道以及绵羊的瘤胃外植体已经被用于试验研究。可能是由于反刍动物独特的消化方式，这些研究主要以细菌或其代谢衍生物与外植体之间的相互作用为切入点开展试验[10]。

和反刍动物外植体相关的研究不断取得新的成果，发现的共同点是随着培养时间的延长，外植体会出现活性逐渐降低，直至完全丧失的现象。而通过调整培养基中的营养成分以及配比，可以延缓外植体活性的丧失时间。

1.1 瘤胃外植体的应用反刍动物的瘤胃主要分为3层，由腔内层到外层依次是黏膜层，黏膜肌层和浆膜层。黏膜层即为瘤胃上皮，分布着大量的角质化乳头。瘤胃外植体保留的是瘤胃上皮，它能够通过上调动物体内与酮体代谢、角蛋白纤维锚定、细菌识别和皮肤屏障等生物学功能有关基因的表达，进化出更强的酮体代谢和调控微生物定植的能力[11]。

有研究通过分离培养绵羊的瘤胃外植体，检测酿酒酵母β-葡聚糖对绵羊瘤胃外植体中β-防御素-1及其mRNA的影响，发现β-葡聚糖能够有效的促进绵羊瘤胃外植体内β-防御素-1的表达，证实瘤胃外植体比单层瘤胃上皮细胞更能够保留与机体相似的组织学特征[12]。FATHI等[13]通过体外模拟绵羊瘤胃模型，首次发现半乳糖凝集素在离体的瘤胃节段模型中上调，认为瘤胃外植体模型是评估细菌脂多糖对绵羊瘤胃外植体影响的合适工具。而瘤胃外植体在培养24 h后，会出现轻微的上皮细胞层脱落，这种现象主要与培养方法，供体动物和分离部位有关，而24 h也被认为是绵羊瘤胃外植体最佳的培养时间[9]。

1.2 肠道外植体的应用肠道保护屏障主要包括黏膜屏障，生物屏障，免疫屏障，机械屏障。任何一个屏障遭到破坏都会影响动物的生理健康状况，而肠道屏障功能的维持主要依靠黏膜免疫系统和肠道菌群之间的相互作用[14]。目前，反刍动物肠道免疫与肠道菌群的研究受限于动物品种、养殖环境和不同生长阶段的养殖模式等因素[15]。肠道外植体可以反映肠内膜在黏附中的作用。ADRIAN等[16]将eaeA基因插入到灭活的大肠杆菌中，进行犊牛肠道外植体黏附试验，证实了肠道外植体内膜的缺失与大肠杆菌的黏附程度无关。FRANCIS等[17]明确了大肠杆菌在牛的结肠，回肠和直肠外植体上的定植、附着和消退的病变变化。此外，有研究用细菌激活剂刺激大肠外植体，明确TNF-α，IL-1RA等细胞因子在大肠外植体内的释放机制，证明肠道外植体可以反映机体对外界刺激产生免疫的机制[18]。肠道外植体在研究菌群调控动物的营养代谢、免疫物质活性和增强抗炎细胞因子表达等方面，起着十分重要的导向作用。

1.3 子宫内膜外植体的应用子宫内膜和机体中大多数黏膜一样，是病原菌侵入机体时第一道发挥作用的防线[19]。它对病原体的免疫反应体系包括补体系统、抗菌肽、免疫球蛋白、急性期蛋白和模式识别受体[20]。细菌感染通常通过先天免疫途径引起牛子宫内膜炎和不孕。然而，直接使用细胞进行的机制研究可能会因为子宫内膜结构的破坏，以及相关分子模式的损伤而受影响，所以完整的子宫内膜外植体模型是研究反刍动物先天免疫和炎症较好的体外模型[21]。有研究建立了完整的子宫内膜体外模型，发现子宫内膜外植体对革兰阴性菌和革兰阳性菌或其识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)都存在功能性的先天免疫应答，该技术为免疫机制的体内观察研究以及体外研究提供一个有效的途径[22]。LI等[23]从奶牛子宫内膜黏膜层中分离出含上皮和间质组织的内膜组织，明确了β-雌二醇对奶牛子宫内膜外植体中前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)功能发挥的影响，发现外植体培养的条件越接近动物体内的生理环境，外植体存活时间也会越长。MIYNARCZUK等[24]在添加不同剂量的农药后发现，质量浓度低于100 μg/L的农药对牛绒毛膜外植体的活性不会产生影响，证实了犊牛绒毛膜外植体存在着与体内相似的反应机制。此外，牛子宫内膜外植体可以间接反映LPS对子宫内膜上皮细胞增殖能力和形态损伤的影响[25]。

2 外植体模型的构建方法

外植体的采集和培养方法需要根据组织的来源以及具体的试验目的来确定。无论是瘤胃外植体，肠道外植体还是子宫内膜外植体，在采取时要求整个过程无菌操作，且组织要完整，为了减缓组织活性的丧失，用含有双抗的PBS缓冲液冲洗掉杂物后，通常在37℃条件下置于含双抗的PBS缓冲液中暂存[26]。

瘤胃外植体需要分离瘤胃组织的浆膜层和黏膜肌层，保留黏膜层，再将黏膜层剪切成4 mm2大小，瘤胃乳头朝上放置于6孔培养板中。在37℃、5% CO2环境中进行培养，使用DMEM/F12培养基即可满足营养需要[27]。在培养基中不添加胎牛血清可能更有利于瘤胃外植体的存活以及形态结构的维持[28]。

肠道外植体的分离方法与瘤胃外植体十分相似，需要保留肠道组织的上皮部分，弃去其他部分。用无菌的PBS缓冲液多次冲洗后，使用DMEM培养基作为培养液，并补充氯霉素，氨苄西林或者四环素，使之终质量浓度分别为10，100，30 mg/L。在37℃、5% CO2的环境中培养6 h后收取样品[29]。也有研究将肠道外植体剪切成12 mm2，置于RPMI 1640培养基中培养[30-31]。

在分离子宫内膜时，用70%的酒精先冲洗子宫外表面，冲洗干净后使用无菌剪刀纵向打开子宫角，再用含抗生素的PBS(50 IU/mL青霉素，50 mg/L链霉素，2.5 mg/L两性霉素B)冲洗暴露的子宫内膜，然后使用无菌剪刀分离出大约2 mm厚的半透明子宫内膜。将之转移到6孔组织培养板中，添加3 mL含有10%灭活胎牛血清的 RPMI 1640培养基。在37℃、5% CO2的环境中培养，每24 h或者更短的时间更换1次培养基[22]。培养期间根据具体的试验设计进行不同的处理,在外植体培养时，需要让组织与空气充分接触，使细胞能够更好的吸收氧气，同时还要防止组织代谢产物造成的培养基过度酸化，导致外植体的存活时间缩短[23]。

总之，培养外植体使用常规细胞培养基DMEM，RPMI 1640、DMEM/F12等可基本满足营养需要，至于是否添加胎牛血清以及添加血清的含量还需要进一步的验证，在不同的研究中使用抗生素的种类和含量也存在一些差异。而目前有关不同培养基以及抗生素对外植体培养效果差异的研究报道较少。因此，在构建外植体模型时，具体的培养方法还需要根据试验的目的和要求进行细节上的变动和完善。

3 外植体活性的评价方法

3.1 细胞角蛋白-18细胞角蛋白(cytokerati，CK)通常在上皮细胞中可以检测到，它与上皮细胞的种类，增殖和分化联系密切，常用来评价上皮组织的完整性以及上皮细胞分化程度[32]。CK有20种，是最大的中间丝蛋白家族成员。在这些CK中，细胞角蛋白-18(cytokerati-18，CK-18)在构成细胞骨架，维持机体组织结构的完整性中发挥着十分重要的作用。

在不同的细胞分化阶段和不同种类的上皮细胞中，CK的表达也是不同的。Ⅰ型CK呈酸性，Ⅱ型CK呈中性或碱性[33]。而CK-18根据酸碱性分类属于Ⅰ型CK，当细胞发生凋亡时，CK-18会被端粒酶特异性裂解[34]。利用CK-18的这种特性可以鉴别培养组织中的细胞是发生凋亡还是发生坏死，即死亡细胞释放CK-18如果为端粒酶裂解，则为细胞凋亡。如果是非裂解形式，则为细胞坏死[35]。

通过检测CK-18的M65片段与M30片段浓度的比值也可以判断培养组织细胞的死亡形式[36]。在细胞发生凋亡时，CK-18会被半胱天冬酶切割，产生的片段会释放到细胞外，这些裂解的片段会进一步促进细胞凋亡。因此，细胞外的 CK-18 浓度间接反映了凋亡细胞的数量，CK-18的M65与M30 2个片段可作为细胞凋亡的标志物[37]。

3.2 抗原Ki-67抗原Ki-67(antigen Ki-67，Ki-67)是一种核蛋白，其基因主要由15个外显子与14个内含子组成[38]。它与细胞内核糖体RNA的转录紧密相关，在细胞增殖过程中的各个周期(G1期，S期，G2期和M期)中都能够表达，只有在细胞静止时期(G0期)不表达[39]。由于Ki-67在细胞增殖时期表现较为活跃，而在细胞停止增殖时则会消失，所以通常称之为细胞增殖指数(proliferation index，PI)，可作为细胞增殖状态的标志反应细胞的增值活跃程度，Ki-67蛋白表达越高，则说明细胞增殖的活性越强[40]。此外，Ki-67具有显示细胞生长活性的特性，利用这种特性判断细胞的增殖活性具有比较高的灵敏度，常用来评估细胞的生长状态[41]。从根本上来看，外植体是诸多组织细胞紧密连接的一个整体，细胞的活性也可以反映整个外植体的活性。因此，Ki-67作为评价外植体活性的指标具有较高的灵敏度以及准确性。

3.3 E-钙黏附蛋白E-钙黏附蛋白(epithelia cadherin，E-cadherin)是黏附蛋白家族中十分重要的一类单链跨膜蛋白，参与机体细胞与细胞间黏附的生理过程。根据钙黏附蛋白的分子结构以及基因序列可以将其分为经典钙黏附蛋白、桥粒钙黏附蛋白、原始钙黏附蛋白以及其他的一些钙黏附蛋白相关蛋白[42]。在反刍动物机体中，它广泛分布于各类组织的上皮细胞中，在维持组织细胞的结构完整以及抑制细胞之间的离散等方面起着十分重要的作用[43]。E-cadherin在动物组织中的表达量逐渐下降时，则表明组织中的细胞黏附能力由强向弱转变，细胞也比较容易从组织中脱落下来，组织的活性也会随之降低[44]。

3.4 苏木精-伊红染色苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，即HE染色，是观察组织细胞形态和结构完整性的常用方法。一般动物外植体正常的生理变化或者是添加某些刺激物之后的形态变化，都可以通过HE染色方法观察出来，这主要是培养组织中的不同成分对染液的亲和力不同造成的[45]。HE染色的切片在经过适当的处理之后，组织中的细胞核会呈现出十分清晰的深蓝色区域，而细胞的细胞质和细胞外基质中的各种成分则会呈现出深浅不一的粉红色，从而能够将各种组织或细胞成分的形态结构特点显现出来[46]。

3.5 细胞计数试剂盒与噻唑蓝法细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)和噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)法是较为普遍的检测动物外植体和细胞活性方法。CCK-8法与MTT法相比有更多的优点，不但能够减少外植体在空气中的暴露时间，降低活性损失，而且CCK-8法检测动物外植体活性的灵敏度也优于MTT法，整个试验过程不需要放射性同位素和有机溶剂，对外植体细胞的毒性很低，外植体细胞形态基本上不会发生变化，而MTT法会导致细胞的形态完全消失。在外植体的培养过程中，分离的样本量是十分多的，所以CCK-8法更加适合动物外植体活性的检测[47]。除了CCK-8和MTT方法外，还有一些比较方便快捷的检测方法，比如XTT钠盐(XTT sodium salt，XTT)法，水溶性四唑盐-1(WST-1)法等。

4 外植体存在的问题与展望

4.1 外植体存在的问题

4.1.1培养存活时间短 外植体的存活时间主要与培养方法、供体动物和分离部位有关[18]。存活时间短的特点也决定了外植体模型仅仅适用于一些试验周期短的研究。而通过进一步丰富培养基中的营养物质，能够延长牛子宫内膜外植体上皮细胞和外周基质细胞的生存时间至48 h[26]。因此，如何进一步优化培养条件，延长外植体存活时间，是外植体培养技术面临的主要问题。

4.1.2组织采取技术要求高 大多数外植体模型的采集都是通过用器械对组织物理切割获得的，对采集的手法和准确度有较高的要求。在采集动物子宫内膜时，需要用手术剪剪开子宫角中间的侧壁部分，再将子宫内膜从子宫肌层上揭下来，这个过程中很有可能会出现子宫内膜破损等情况[28]。

4.1.3组织处理精确度低，误差大 当试验有较多的分组或对组织块大小有要求时，这个问题是无法避免的。目前并没有特定的器材能够准确而快速的将组织处理成相同的大小。利用普通的手术器械操作误差较大，很难保证每个分组中组织的大小相同，会给试验结果带来较大的影响[48]。

4.2 展望近年来，诸多学者从试验中发现问题，解决问题，对外植体存活时间短，组织处理操作困难等问题进行了积极的探索[9-13]。进一步改进了外植体的培养技术方案，对外植体培养技术的应用与发展起到了极大的推动作用，促进了反刍动物外植体培养技术的完善与进步。但由于诸多外植体培养技术存在一些差异，尤其是环境条件，营养供应和生长因子等方面，对试验结果会造成不同程度的影响，导致外植体培养技术的使用范围仍具有一定的局限性[49-51]。因此，我们需要根据外植体的来源以及试验目的等因素，整合各个培养方案中的优点，建立一个有针对性的、系统的、标准化的培养方案。

随着新研究的不断进行，反刍动物外植体培养技术也会日趋完善。这项技术的应用和普及有利于充分发挥外植体的优势，降低试验成本，丰富研究内容，为反刍动物营养代谢，黏膜免疫机制，感染预防以及治疗等方向的研究提供试验基础。在生产实践方面，也能为解决养殖生产中存在的问题提供一定的理论帮助。