花棒种子萌发对NaCl及聚乙二醇胁迫的响应

邹 瑾， 王晓佳， 曹 兵*， 李运毛， 冯学瑞， 刘佳欣

(1. 宁夏大学农学院， 宁夏 银川 750021； 2. 宁夏银川市中山公园， 宁夏 银川 750001)

我国西北地区为大陆性气候区，降水稀少，植被分布稀疏，土壤蒸发量较大，盐分在地表聚集，导致盐渍化问题显著[1]，荒漠化问题长期存在，生态环境修复问题受到广泛关注。许多学者对西北地区的荒漠化治理、植被恢复以及对盐渍化土地的开发利用等问题进行了研究，认为改善本地区生态环境最有效、最经济的生物措施是栽种耐盐、耐旱植物[2-4]。花棒(HedysarumscopariumFisch. et Mey.)为豆科岩黄耆属半灌木，其生长迅速，根系发达，树形独特，具有抗旱、耐风蚀、适应性强的特点，是优良的固沙灌木树种[5]。花棒不仅可以营造独特的沙漠景观，其根际和非根际中的根瘤菌与其本身共生形成根瘤，实现共生固氮，对当地生态平衡的维持、土壤改良等有着重要贡献。此外，其枝干中富含油脂，可以作为生物燃料的补充，嫩枝叶可成为牛羊饲料，种子可以榨油[6]，花期较长，花色艳丽，不仅可以用来作为潜在能源植物[7]，也是优质的蜜源植物[8]。由此可见，花棒的生态和经济价值都十分显著[9]。生产中主要通过植苗和直播造林方式应用，花棒种植方式简单、成本较低，被广泛用于沙区生态环境的修复治理。

对于干旱荒漠区植物种子而言，盐分和湿度是测定其抗逆性的重要影响因素[10-12]，研究植物抗逆性的关键时期是种子萌发时期。在植物所遭受的各种非生物灾害中，干旱对其生长造成的危害最为严重[13]；盐适应性是盐生环境下植物生存的首要条件，亦是干旱区植物长期进化过程中需适应的重要因子[14]。采用NaCl和PEG-6000处理种子，分别模拟盐、旱胁迫环境，探究植物种子萌发期的抗逆性[15]，这种试验方法已在柠条[16-17]、刺铃铛[18]、沙蒿[19]等植物的抗盐旱研究中成功应用，但不同植物其种子萌发期、苗期、幼年期等不同生长发育阶段对土壤水分和盐分有不同的适应性[20]。花棒根系发达、叶片小，抗旱性强，是干旱沙区植被恢复与重建的优选树种之一。目前对花棒的研究主要集中在沙埋深度影响[21]、环境因子影响[22]及其生理生态[5]等方面，未见有关其种子萌发期抗旱、耐盐的研究报道。本试验采用不同浓度的NaCl溶液和PEG-6000溶液，分别模拟不同程度盐胁迫和干旱胁迫环境，测定花棒种子萌发指标，分析花棒种子萌发期对盐、旱胁迫的反应，以期为花棒的人工培育及直播造林提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花棒种子于2021年在宁夏上谷农牧种子公司购买。试验所用盐(NaCl)、聚乙二醇6000(PEG-6000)分析纯试剂，均为天津市大茂化学试剂厂生产。

1.2 试验方法

1.2.1种子预处理 试验前挑选种粒饱满、大小相同、无病虫害的花棒种子，去除果荚[22]，用0.3%的高锰酸钾溶液浸泡消毒(10 min)后，用蒸馏水进行反复冲洗，滤纸吸干表面水分备用。

1.2.2试验设计 试验采用纸上发芽法，配置不同浓度的NaCl溶液和PEG-6000溶液，分别模拟不同程度盐胁迫和干旱胁迫环境下花棒种子的萌发状况。按照Michel[23]、陈东凯[19]等的方法，结合预试验结果，本试验确定设置5个不同浓度(质量分数)NaCl溶液，分别为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%模拟盐胁迫[24-25]；设置5个不同浓度(质量分数)PEG-6000溶液，分别为5%，10%，15%，20%，25%模拟干旱胁迫[26-27]，PEG-6000浓度对应水势为-0.10，-0.20，-0.40，-0.60，-0.86 MPa[28]。试验共设置12组处理，其中蒸馏水对照(CK1，CK2)2组，NaCl溶液5组，PEG-6000溶液5组；每组处理3个重复，共计36个培养皿，每培养皿放置30粒种子，培养皿标记处理编号。先将培养皿(内径90 mm)用高压灭菌锅进行消毒30 min，取出放入双层大小与培养皿内径一致的干净无菌滤纸。用移液枪往对应编号的培养皿中分别加入不同浓度的NaCl溶液及无菌蒸馏水(CK1)、不同浓度的PEG溶液及无菌蒸馏水(CK2)，至滤纸饱和并依次称重记录。将所有处理的培养皿放入人工气候箱中培养，温度为25℃、湿度60%、光照昼夜时间为12 h/12 h。每天定量加入各溶液，补充散失水分，同时称重并做好记录，每2 d更换滤纸，维持正常环境水势[29]。

1.3 指标测定及方法

本试验从种子置床之日起每隔24 h观察1次，种子露白即可认定为萌发；在3次重复中，有1粒以上的种子出现萌发，可认定是种子萌发开始期，每天在规定的时间内观察种子萌芽情况并做好记录[18]，参照《国际种子检验规程》，以连续3 d无种子发芽作为发芽试验的结束。完成试验后，做好各指标计算工作，选择胚根完整的10株幼苗，用精度为0.02 mm的数显游标卡尺测量其胚根长并取平均值。正常萌发阈值的确定参照《GB7908-1999林木种子质量分级》[30]，以花棒一级种子发芽率为标准，发芽率高于70%而低于对照组，则认定为该浓度对种子萌发有影响；发芽率低于70%，则被认定该浓度抑制了种子萌发，其他萌发指标参照发芽率抑制浓度，以对照组的50%为标准判定。

逐日萌发率(Daily germination rate，DGR)=t/N×100%，t为萌发期内每天正常发芽种子数量。

发芽率(Germination rate，GR)=n/N×100%，n代表正常发芽种子数量，N为种子总数。

发芽势(Germination potential，GP)=m/N×100%，m为总萌芽天数前1/3 d种子发芽数量。

发芽指数(Germination index，GI)=∑(Gt/Dt)，Gt为在t天发芽种子数量，Dt为对应发芽天数。

活力指数(Vigor index，VI)=GI×Sx，Sx为种子胚根长度。

1.4 数据处理

使用Microsoft excel 2010对数据进行整理，用SPSS 26.0软件进行统计分析(多重比较选择Duncan方法，其中置信水平具体为95%)，用Origin 2018软件来进行绘图。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对花棒种子萌发的影响

2.1.1盐胁迫对花棒种子逐日萌发率的影响 在不同NaCl浓度处理下，花棒种子起始萌发天数分别为第1，1，1，4，5，5 d(图1)。随NaCl浓度不断升高，花棒种子起始萌发时间延后，不同浓度NaCl对花棒萌发存在不同程度抑制作用：种子逐日萌发率峰值均明显低于CK1，当盐胁迫逐步增强时，种子逐日萌发率峰值出现时间明显滞后，种子停止萌发天数对应分别为第6，11，14，14，12，14 d。

图1 不同浓度NaCl胁迫对花棒种子逐日萌发率的影响Fig.1 Effects of different concentrations of NaCl stress on daily germination rate of Hedysarum scoparium seeds

2.1.2盐胁迫对花棒种子发芽率及发芽势的影响 不同浓度NaCl溶液处理，花棒种子发芽率、发芽势差异性显著(图2)。随着NaCl浓度逐渐升高，花棒种子的发芽率整体呈下降趋势，且与对照组表现出显著差异(P<0.05)。当使用0.2%浓度的NaCl溶液处理种子时，花棒种子发芽率为83.3%，高于70%，为对照组的87.1%；当NaCl溶液浓度为0.4%时，种子发芽率为46.7%，为对照组的47.1%，出现明显抑制作用；当溶液浓度达到1.0%时，种子的发芽率低至8.9%，仅为对照组的9.3%。说明当NaCl浓度逐步升高时花棒种子的发芽率呈线性降低，当NaCl浓度为0.2%时，花棒种子发芽率受到一定影响，当NaCl溶液浓度达到0.4%时，花棒种子发芽率明显降低，该浓度明显抑制种子发芽。

图2 不同浓度NaCl胁迫对花棒种子发芽率与发芽势的影响Fig.2 Effects of different concentrations of NaCl stress on germination rate and germination potential of Hedysarum scoparium seeds注：不同小写字母表示同一溶液不同浓度处理下差异显著(P<0.05)，下同Note:Differen lowercase letters indicate the significant difference under different concentrations of the same solution at the 0.05 level,the same as below

发芽势是指在种子萌发试验中，从开始发芽到最高峰时，已经发芽的种子数占测试种子总粒的比重[31]。当NaCl溶液浓度逐步升高时，花棒种子发芽势整体呈下降趋势。用0.2%浓度NaCl溶液处理花棒种子时，其发芽势为50%，为对照组的52.3%；当NaCl溶液浓度达到0.4%时，其发芽势为1.1%，仅为对照的10.4%，出现明显抑制作用；随着浓度增高，花棒种子发芽势急剧降低，与对照存在显著差异(P<0.05)。

2.1.3盐胁迫对花棒种子发芽指数及活力指数的影响 发芽指数是指测试种子发芽成活指数情况，用来表示该测试种子实际均值发芽率[32]。花棒种子在不同浓度NaCl溶液处理后，其发芽指数和活力指数总体皆呈下降趋势，且差异显著(图3)。当使用0.2%浓度的NaCl溶液处理花棒种子时，种子发芽指数为36.1，为对照组的54.8%；当NaCl浓度达到0.4%时，其发芽指数为10.9，为对照的16.5%，产生明显抑制作用(P<0.05)；当NaCl浓度达到1.0%时，其发芽指数仅为1.3，为对照的2.0%。可见，随着处理浓度的升高，花棒种子发芽指数下降幅度明显增加，受抑制作用明显。

图3 不同浓度NaCl胁迫对花棒种子发芽指数与活力指数的影响Fig.3 Effects of different concentrations of NaCl stress on germination index and vigor index of Hedysarum scoparium seeds

活力指数用来表示种子迅速整齐萌发潜势和生长力情况[33]。在NaCl溶液的不同浓度处理下，花棒种子的活力指数整体呈下降趋势。当使用0.2%浓度的NaCl溶液处理花棒种子时，种子活力指数为4.0，为对照组的42.6%，开始产生抑制作用；当使用NaCl浓度达到0.4%时，其活力指数为0.7，仅为对照组的7.4%，产生明显抑制作用(P<0.05)。可见，相对于其他萌发指标，活力指数对NaCl胁迫响应较为敏感。

2.2 干旱胁迫对花棒种子萌发的影响

2.2.1干旱胁迫对花棒种子逐日萌发率的影响 干旱胁迫下花棒种子起始萌发天数分别为第1，1，1，1，1，3 d(图4)。当PEG-6000溶液达到25%的浓度时，花棒种子起始萌发的时间延后，抑制了萌发进程。当PEG-6000溶液为5%，10%，15%时，花棒种子逐日萌发率的峰值分别为36%，24%，17%，均小于对照组CK2，但与对照组的逐日萌发率峰值同天出现。当PEG-6000溶液浓度≥20%时，种子逐日萌发率的峰值出现明显滞后现象。

图4 不同浓度PEG-6000胁迫对花棒种子逐日萌发率的影响Fig.4 Effects of different concentrations of PEG-6000 stress on daily germination rate of Hedysarum scoparium seeds

2.2.2干旱胁迫对花棒种子发芽率及发芽势的影响 随着PEG-6000溶液浓度逐步升高，花棒种子发芽率及发芽势呈下降趋势(图5)。当PEG-6000溶液为15%时，花棒种子的发芽率达到87.7%，为对照的91.6%，此时与对照组差异不显著；当溶液浓度达到20%时，种子发芽率开始降低为67.7%，与对照组差异显著(P<0.05)；当PEG-6000溶液为25%时，花棒种子发芽率降低至25.7%，仅为对照组的26.9%。可见，当PEG-6000溶液浓度高于20%时，发芽率低于70%，该环境对花棒种子发芽率存在显著抑制作用。

图5 不同浓度PEG-6000胁迫对花棒种子发芽率和发芽势的影响Fig.5 Effects of different concentrations of PEG-6000 stress on germination rate and germination potential of Hedysarum scoparium seeds

对于发芽势来说，当PEG-6000溶液浓度为5%时，种子发芽势为86.7%，为对照组的90.7%，与对照组无显著差异；当溶液浓度达到10%时，种子发芽势为77.0%，为对照组的80.5%，与对照组产生显著差异(P<0.05)，但与5%浓度处理发芽势差异不显著；当溶液浓度逐步增加到15%时，其种子发芽势为52.2%，为对照组的54.6%；当浓度增加至20%时，花棒种子发芽势为31.1%，仅为对照组的32.5%，产生明显抑制作用；当溶液浓度达到25%时，花棒种子发芽势降低至5.6%。因此，随着PEG-6000溶液浓度的升高，花棒种子的发芽率及发芽势均呈下降趋势，当PEG-6000溶液浓度高于15%时，对花棒种子的发芽率及发芽势产生明显抑制作用。

2.2.3干旱胁迫对花棒种子发芽指数及活力指数的影响 随着PEG-6000溶液浓度的升高，花棒种子的发芽指数与活力指数均呈下降趋势(图6)。当PEG-6000溶液浓度为5%时，花棒种子发芽指数为62.3，与对照组无显著差异；当PEG-6000溶液浓度为10%时，其发芽指数为53.6，为对照组的83.4%，虽未产生抑制作用，但表现出显著差异(P<0.05)；当PEG-6000溶液浓度为15%时，种子发芽指数为35.6，为对照组的55.4%，没有产生明显抑制作用；当溶液浓度为20%时，种子发芽指数为22.0，为对照组的34.2%，此时产生明显抑制作用；在溶液浓度达到25%时，种子发芽指数仅为5.0。

图6 不同浓度PEG-6000溶液胁迫对花棒种子发芽指数与活力指数的影响Fig.6 Effects of different concentrations of PEG-6000 stress on germination index and vigor index of Hedysarum scoparium seeds

随着PEG-6000溶液浓度不断升高，花棒种子活力指数下降幅度不断增大，表现出显著差异(P<0.05)。当溶液浓度为5%时，其活力指数为7.4，为对照的79.6%；当PEG-6000溶液浓度为15%时，花棒种子活力指数为3.8，为对照组的40.4%，开始产生抑制作用；当溶液浓度升高至20%时，其活力指数为1.3，为对照组的14%，抑制作用明显；当溶液浓度达到25%时，其活力指数仅为0.1，为对照组的1.0%。由此可得出，随着PEG-6000溶液浓度升高，种子活力指数下降，当PEG-6000溶液浓度大于15%时，活力指数下降趋势明显，种子生长潜力明显降低，可见花棒种子活力指数对PEG-6000胁迫响应较为明显。

3 讨论

3.1 花棒种子萌发对NaCl胁迫的响应

本试验通过运用不同浓度NaCl溶液模拟不同程度盐胁迫环境，观察记录花棒种子在盐胁迫环境下萌发情况，探讨花棒种子的耐盐性。关于NaCl溶液对种子萌发的影响，目前有两种结果，乔枫、朱金方等在沙棘[34]和柽柳[35]种子上得出的研究结果显示，低浓度NaCl胁迫有助于种子萌发[3]，高浓度时则存在抑制作用。张建锋等[36]在研究流苏和香椿种子时得出结果显示，各浓度NaCl胁迫均会抑制种子萌发，且浓度越大，引发的抑制作用会越明显。本试验得出的结果与张建锋等研究结果相似。当NaCl浓度为0.2%时，花棒种子内部膜系统可以有效修复[37]，该浓度发芽率为83.3%，未产生抑制作用；随着NaCl浓度增加，种子内部膜系统的修复逐渐延缓，当浓度达到0.4%时，种子内部膜系统不能修复，发芽率仅为46.7%，受抑制作用较为明显。在本试验中，低于0.2% NaCl浓度并未抑制种子的萌发，当浓度不断升高时，花棒种子各项萌发指标急剧下降。由此可推知，在含盐量较低的环境下，花棒种子具有一定的耐受性，该研究结果和杨佳鑫[38]、朱金方等[35]研究观点相似，后期应开展系统选育，以培育耐盐品种，探究利用沙区地下盐水进行固沙造林的方法。

3.2 花棒种子萌发对模拟干旱胁迫的响应

PEG-6000是常见的大分子渗透调节剂，通过对种子渗透压进行调整，改变水势环境，对水分进入种子内进行限制[39]，使种子内的各种细胞、酶处于活化状态。因此，采取PEG-6000溶液处理花棒种子，模拟干旱对种子的胁迫试验，实际上是利用其对种子所具有的这种渗透调节作用[40]。通过本试验发现，当PEG-6000溶液≤5%时，花棒种子萌发能力受到影响并不显著，当溶液浓度高于15%时，花棒种子各萌发指标均与对照存在显著差异。可见，当PEG-6000浓度≤15%时，花棒种子的发芽能力未受到明显影响；而当溶液浓度达到20%时，各项发芽指标明显受抑制作用；当PEG-6000溶液浓度为25%时，对应环境水势具体为-0.86 MPa[41]，在这种环境下花棒种子的发芽率为25.6%，说明在重度干旱胁迫环境下，花棒种子也具有一定的耐受性。有研究表明，轻微干旱胁迫环境能促使种子启动自我保护机制，缓解种子吸胀过程中对膜系统造成的损伤，这对修复膜系统极为有益，进而有助于植物种子发芽率的提升[42-43]。姜生秀、刘帅等对沙冬青[44]、沙棘[34]、柽柳[45]等沙生植物抗旱性研究结果与上述结果一致。本试验得出的结果与上述结果不同，花棒种子的发芽率受种子采摘年份影响较大，低浓度PEG-6000环境对花棒种子发芽率的提升不明显，所以轻微干旱是否能促使种子萌发，可能还与受到胁迫种子的种类、采摘年份及其生长环境等因素有关。

通过本试验可知，花棒种子萌发能力随NaCl和PEG-6000溶液浓度的升高均呈下降趋势，揭示了花棒种子萌发的NaCl和PEG-6000浓度界限，对其选择适宜栽植的环境条件和区域提供参考价值。本试验初步得到了花棒种子在盐旱条件下的萌发阈值，但是花棒种子在萌发过程中，其生理指标受盐旱胁迫下出现的具体特征、相应变化以及构建耐盐基因载体，改良植株培育等问题，还需要进行深入研究。

4 结论

本试验结果表明，随着NaCl浓度的升高花棒的萌发能力呈下降趋势，当NaCl浓度高于0.2%时，种子各项萌发指数均急剧下降，说明花棒耐盐性相对较低。随着PEG-6000溶液浓度的升高花棒种子萌发能力同样呈下降趋势，当PEG-6000溶液浓度高于15%时，种子各萌发指标显著降低，种子萌发受抑制作用明显。因此，花棒种子萌发能忍耐的模拟盐胁迫和干旱胁迫的浓度分别为0.2% NaCl，15% PEG-6000，花棒种子萌发期能忍耐低盐分、中度干旱胁迫。