气相色谱-质谱联用法测定红糖中的丙烯酰胺

方丽，王李平，张方圆，李雪莹，潘云山，张丽，黄嘉颖

(广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东省保健食品功效成分检测与风险物质快速筛查工程技术研究中心，广州 510070)

红糖(brown sugar)指带蜜的甘蔗成品糖，以甘蔗为原料，经提取糖汁、清净处理后，直接煮炼，不经分蜜炼制而成[1]。整个加工过程中不加入除石灰外任何化学试剂及食品添加剂，完全保留甘蔗原有风味和营养物质。红糖与白砂糖、赤砂糖等精制糖不同，是一种非分蜜糖，即未经过分蜜处理制成的糖。在未大规模生产精制糖时期，甘蔗糖的主要消费形式即非分蜜糖。在全球范围内有不同的名称和形态，广为人知的是日本冲绳黑糖(Kokuto)、拉丁美洲红糖(Panela)和南亚、非洲粗糖(Jaggery)等，本质上来说它们都是甘蔗汁的浓缩产物[2]。

红糖主要成分为蔗糖、果糖、葡萄糖等，另外还含有被认为是益生元的低聚果糖，含量高达500 mg/g[3]。作为甘蔗的全汁浓缩物，红糖保留了甘蔗中的大部分营养物质，含有具有抗氧化作用的甘蔗多酚，如奎尼酸、原儿茶酸、阿魏酸等多种酚酸[4]。还含有微量的参与人体代谢和细胞调节的维生素，包括维生素A、维生素E、维生素D、烟酸、泛酸等[5]。陈其钊等[6]的研究表明，红糖中的植物甾醇含量明显高于赤砂糖，而植物甾醇对于预防和治疗冠状动脉粥样硬化、促进伤口愈合等方面具有积极作用。红糖中包含铁、锌、锰、铜、硒等多种微量元素[7]，这些微量元素是人体代谢必需的活性因子。红糖与其他功能性药食同源植物合理配伍，能够增强其保健功效，因此出现了生姜红糖、益母红糖等功能性红糖。除了上述保健作用外，红糖还具有调节风味的作用，其中含有几十种香气物质[8]。Tian等[9]研究表明红糖对鸡肉调味品的风味品质具有积极影响。Chen Erbao等[10]通过GC-O-MS对红糖的气味进行了分析，检测到丰富的美拉德反应产物(如吡嗪类和呋喃酮类物质)。

丙烯酰胺是一种具有亲电基团的有机小分子，对人体的神经系统、免疫系统和遗传物质都有一定的毒性[11]，世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将其列为2A类致癌物，即“人类可能致癌物”。天冬酰胺参与的美拉德反应是食品中丙烯酰胺的主要来源[12]，发现丙烯酰胺主要存在于薯条、面包、咖啡等油炸、焙烤食品中，而红糖中存在丙烯酰胺鲜有报道。丙烯酰胺的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法，以及新型的检测技术如基于褐变的快速测定、毛细管电泳法、酶联免疫分析技术、生物传感器法及荧光传感法[13]。本文以红糖作为研究对象，优化并建立其中丙烯酰胺含量的检测方法。

1 实验部分

1.1 试剂材料

1.1.1 样品

红糖样品选取云南、广西、广东、江苏4个国内主要的红糖生产地区所生产的红糖，以及从两个国家进口的红糖。样品购买后密封于冰箱中冷藏贮存。

1.1.2 标准物质

丙烯酰胺(Acrylamide，简称AM，CAS：79-06-1)：1000 μg/mL，介质甲醇，提供商为农业农村部环境保护科研监测所；丙烯酰胺内标(13C3-Acrylamide，简称13C3-AM，CAS:287399-26-2)：1000 μg/mL，介质甲醇，提供商为First Standard。

1.1.3 试剂

乙酸乙酯(色谱纯，Honeywell)、甲醇(色谱纯，Honeywell)、溴化钾(分析纯，广试)、溴酸钾(分析纯，广试)、无水硫酸钠(分析纯，广试，在650 ℃下灼烧4 h，贮存于干燥器中，冷却备用)、硫代硫酸钠(分析纯，麦克林)、实验用水为超纯水。

1.1.4 基质分散材料

乙二胺-N-丙基硅烷PSA(150 mg MgSO4+50 mg PSA/2 mL)、乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅胶PSA+C18(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18/2 mL)、乙二胺-N-丙基硅烷和石墨化炭黑PSA+GCB(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB/2 mL)。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 AM标准溶液

取0.25 mL AM标准溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 μg/mL的AM标准溶液，在-18 ℃下保存。

1.2.213C3-AM内标溶液

取0.25 mL13C3-AM标准物质溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 μg/mL的内标溶液，在-18 ℃下保存。

1.2.3 标准工作溶液曲线

分别取0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，0.8，1.0 mL的10 μg/mL AM标准溶液和0.5 mL的10 μg/mL13C3-AM内标溶液于10 mL容量瓶中用超纯水定容至10 mL，得10，50，100，200，500，800，1000 ng/mL内标浓度为500 ng/mL的标准工作溶液曲线，临用时配制。

1.3 仪器设备

Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(配有电子轰击源) 美国安捷伦科技公司；E320食品料理机 美国Vitamix公司；多位试管涡旋振荡器 德国Heidolph公司；N-EVAP 112氮吹仪 美国Organomation；移液器 美国Gilson公司；电子天平 德国Sartorius公司；CF 16RXⅡ高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；MPR-210冰箱 日本松下电器(中国)有限公司；50 mL三角瓶、250 mL分液漏斗 博美(北京)玻璃有限公司；比色管(10 mL和100 mL) 天津天玻科技发展有限公司。

1.4 样品前处理

将红糖样品放入食品料理机内，打碎混匀后，收集在密封袋中做好标示，备用。称取5 g(精确至0.001 g)制备样于50 mL离心管中，加入20 mL超纯水，涡旋10 min后放入冰箱中冷藏待反应。称取5 g溴化钾于100 mL比色管中，加入10 mL超纯水，涡旋溶解后，依次加入6 mL 10%浓硫酸溶液、冷藏的样品溶液和20 mL 0.4 mol/L溴酸钾溶液，避光置于4 ℃冰箱中反应30 min，反应结束后，加入40 mL饱和的硫代硫酸钠溶液，转移至250 mL分液漏斗中，用50 mL乙酸乙酯分3次萃取，收集乙酸乙酯层，加入无水硫酸钠脱水后，氮吹至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL。将定容后溶液移入PSA+C18的净化管内，涡旋1 min，4000 r/min离心3 min后，取上清液，进行GC-MS分析，测试样品。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：DB-Heavywax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样量2 μL，进样口温度250 ℃；进样模式：脉冲不分流；载气：高纯He，纯度99.999%；流速：1.2 mL/min；升温程序：65 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，再以40 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。

1.5.2 质谱条件

离子源：电子轰击式离子源(EI，70 eV)；离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度240 ℃；溶剂延迟5 min；采集模式：选择离子检测(SIM)，AM(151,133,135,106)；13C3-AM(154,152,136,110)，其中带下划线的质荷比(m/z)为定量离子，其余3个为定性离子。

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件的优化

丙烯酰胺溶于水，且红糖在水中易于溶解，因此直接将红糖样品经涡旋溶解于超纯水后，用于溴化衍生。由于衍生产物2,3-二溴丙酰胺微溶于水，易溶于乙酸乙酯，且有机化合物在两种溶剂中的分配系数介于0.1～100之间，用一定量的溶剂分批多次萃取的效率要比一次萃取效率高，因此衍生结束后，加入饱和的硫代硫酸钠消除多余的溴单质，采用50 mL乙酸乙酯分3次对衍生产物进行萃取，收集乙酸乙酯层，脱水、浓缩、净化后，用GC-MS进行分析。

由于丙烯酰胺在熔点温度时很容易聚合，气相色谱无法实现对其低浓度含量的分析。且其相对分子量仅为71，离子化碎片主要为71，55，44，27，碎片m/z小，进行GC-MS分析时，干扰较大。因此，采用溴化加成，使丙烯酰胺转换为2,3-二溴丙酰胺，增加了丙烯酰胺的热稳定性以及对检测器的灵敏度和选择性，再用GC-MS进行分析。

溴单质的获取途径为溴化钾-溴酸钾与浓硫酸混合反应。利用在极性溶剂中，溴容易发生异裂，生成溴离子，与丙烯酰胺中的烯键发生加成反应，生成2,3-二溴丙酰胺，反应结束后，用硫代硫酸钠溶液除去多余的溴单质，反应方程式如下：

5KBr+KBrO3+3H2SO4=3Br2+3H2O+3K2SO4。

CH2=CHCONH2+Br2=CH2BrCHBrCONH2。

Na2S2O3+4Br2+5H2O=Na2SO4+H2SO4+8KBr。

由于加入的溴化钾和溴酸钾过量，能够满足衍生反应要求，反应过程所涉及的关键因素为浓硫酸溶液的加入量、反应温度以及反应时间。

2.1.1 影响溴化加成反应转化率的单因素实验考察

先通过单因素实验分别对这3个因素进行五水平实验考察。首先对最主要的因素——浓硫酸加入量进行考察，分别选取10%浓硫酸加入量为2，4，6，8，10 mL这5个水平，反应温度4 ℃，反应时间30 min，以不同水平实验作为横坐标、相对响应值作为纵坐标，绘制浓硫酸溶液加入量对反应结果影响的单因素实验曲线，见图1。

图1 浓硫酸溶液的加入量对结果的影响

由图1可知，随着10%浓硫酸加入量的逐渐增大，反应转化率呈上升趋势，当加入量超过8 mL时，继续增加加入量，相对响应值无明显变化，故选择10%浓硫酸的加入量为8 mL。

考察不同温度下溴化加成反应转化率。丙烯酰胺极易升华和聚合，在室温条件下稳定。用于反应的溴单质在常温、常压下是具有挥发性的红黑色液体，且溴蒸气具有腐蚀性、有毒。因此，根据丙烯酰胺和溴单质的理化性质，考察温度时分别选取0，4，8，12，16 ℃这5个水平，加入8 mL的10%浓硫酸，反应时间30 min，以不同水平实验作为横坐标、相对响应值作为纵坐标，绘制温度对反应结果影响的单因素实验曲线，见图2。

图2 反应温度对结果的影响

由图2可知，当温度为4 ℃时，相对响应值最大，随着反应温度的上升，相对响应值反而下降，可能与丙烯酰胺的稳定性有关。

考察不同时间下溴化加成反应转化率。考察反应时间时分别选取10，20，30，40，50 min这5个水平，加入8 mL的10%浓硫酸，反应温度为4 ℃，以不同水平实验作为横坐标、相对响应值作为纵坐标，绘制时间对反应结果影响的单因素实验曲线，见图3。

图3 反应时间对结果的影响

由图3可知，随着反应时间的增加，相对响应值呈现逐渐上升的趋势，当时间为40 min时，相对响应值达到峰值，因此选择反应时间为40 min。

单因素实验存在各因素之间没有交互作用这个假定，而在实际问题中，各因素相互独立的情况极少。在单因素实验结论的基础上，同时采用响应面设计进行三因素三水平实验，对衍生条件进行进一步优化。

2.1.2 影响溴化加成反应转化率的响应面优化

根据Box-Behnken Design的中心组合设计原理，结合单因素实验结果，进行三因素三水平的响应面分析实验，因素和水平选择见表1。

表1 响应面实验因素与水平

以10%浓硫酸加入量(A)、反应温度(B)和反应时间(C)为自变量，以反应后产物2,3-二溴丙酰胺的响应值比率为响应值(Y)进行响应面分析实验，分析方案及结果见表2。

表2 响应面分析方案及实验结果

通过Design-Expert软件程序进行二次回归响应分析，建立多元二次响应面回归模型：Y=11.21A+3.92B-0.18C-8.09AB+1.29AC+3.8BC-9.37A2-15.28B2-9.81C2，对其进行显著性检验与方差分析，见表3。

表3 二次响应面回归模型方差分析

由表3可知，回归模型的P值<0.001，表明该模型回归效果显著，可反映实际结果的R2=0.9929，表明模型的拟合结果与实际结果相关度高，失拟项的P值为0.2673>0.05，表明该回归方程拟合度较高，误差对实验结果影响较小。在所有作用因素中，一次项A、交互相AB以及二次项 A2、B2、C2对目标化合物的反应转化率影响极显著(P<0.001)。由表3中F值可知，各因素对溴化加成反应转化率影响大小顺序为：10%浓硫酸加入量(A)>反应温度(B)>反应时间(C)。

利用Design Expert软件，通过多元回归方程做出响应面图，见图4。因素间交互效应的强弱可由等高线图的形状来分析。等高线图越接近于椭圆，表明因素之间的交互作用越强烈[14]。

图4 两因素交互影响反应转化率的响应面

由图4可知，10%浓硫酸加入量和反应温度(AB)的交互作用最为显著，其次是10%浓硫酸加入量和反应时间(AC)，影响最小的为反应温度与反应时间(BC)。最终确定溴化加成反应的条件为10%浓硫酸加入量为8 mL，反应温度为4 ℃，反应时间为40 min，并以2,3-二溴丙酰胺标准物质(CAS:15102-42-8)作为基准，确定反应产物浓度，得到上述条件下的反应转化率为98.7%，完全满足方法要求。

2.2 净化条件的确定

由于红糖所包含的成分较多，在衍生化反应过程中，亦会引入部分杂质，在GC-MS分析时体现为杂峰多、基线上升，从而影响定量、定性结果的准确性。该实验净化利用基质分散萃取机理，采用吸附剂与碳水化合物等干扰物结合，通过离心方式去除，从而达到净化的目的。比较了3种不同的混合型基质分散净化物，乙二胺-N-丙基硅烷PSA、乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅胶PSA+C18、乙二胺-N-丙基硅烷和石墨化炭黑PSA+GCB。3种基质分散净化物均能有效去除干扰，降低基线，减少杂峰数目，明显改善AM、13C3-AM峰高，其中PSA+C18的改善效果最为明显，净化前后对比见图5。

图5 红糖样品净化前后对比

2.3 色谱条件优化

丙烯酰胺溴化加成的产物2,3-二溴丙酰胺作为有机卤化物，属于极性分子，根据相似相溶原理，选取具有强偶极力的聚乙二醇(PEG)作为固定相，2,3-二溴丙酰胺具有较高的沸点，且在WAX色谱柱上240 ℃左右出峰，而Heavywax属于耐高温的WAX色谱柱，温度上限为恒温280 ℃，高于一般的WAX色谱柱，能够有效地缩短运行时间，且在高温段的后段运行烘烤色谱柱，有助于将气化进入色谱柱的高沸点物质赶出，有助于减少样品的基质效应，降低交叉污染以及出现鬼峰的风险。对于典型的需要低载气流速的GC-MS系统，选择0.25 mm内径较小的色谱柱，因此选择DB-Heavywax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱。柱温是影响分析时间和分离度的重要因素，采用程序升温模式能够有效地使目标物和干扰物分离，获得准确的结果，由于对单一物质进行分析，阶段升温设置相对简单：65 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，再以40 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。获得的溴化反应后的丙烯酰胺及13C3-丙烯酰胺总离子流图见图6。

图6 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺总离子流图

2.4 质谱条件优化

溴化反应后的丙烯酰胺及13C3-丙烯酰胺在70 eV的能量轰击下，相应的质谱图见图7，获得的碎片离子见表4。

表4 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺分子式及质谱参数

图7 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺溴化物质谱图

由于溴有2种稳定同位素：Br-79(50.69%)和Br-79(49.31%)，占比相似，特征性很强。因此，在同一碎片离子间存在m/z为2的差距，且该碎片具有近乎一致的相对丰度值。其中149作为邻苯二甲酸酯的特性离子，邻苯二甲酸酯存在广谱污染性，经常存在于实验室溶剂中；108作为丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺溴化物共有的碎片离子，且作为碳13标记的内标物质与目标物出峰时间相同；136作为柱流失的特征离子，会造成高温段的基线升高，影响灵敏度，因此在选择离子时应尽量避开这3个碎片离子。

2.5 方法学评价

2.5.1 线性范围、检出限及定量限

以AM浓度作为横坐标、AM与13C3-AM峰面积的比值作为纵坐标，采用最小二乘法进行回归分析，得到浓度在0.0100～1.00 μg/mL丙烯酰胺的线性拟合方程Y=8.3466X+0.0762(Y为丙烯酰胺峰面积与内标13C3-丙烯酰胺的比值，X为丙烯酰胺的质量浓度)，相关系数R2为0.9999。以3倍信噪比确定方法检出限(LOD)为0.4 μg/kg，以10倍信噪比确定方法定量限(LOQ)为1.3 μg/kg。

2.5.2 精密度和回收率

选取2种不同丙烯酰胺含量的红糖进行精密度和回收率实验。对低浓度丙烯酰胺含量的红糖样品，分别选取25，50，100 μg/kg低、中、高3个水平进行6个平行加标回收实验；对高浓度丙烯酰胺含量的红糖样品，分别选取200，400，800 μg/kg低中高3个水平进行6个平行加标回收实验，得到相应的回收率和相对标准偏差见表5。

表5 不同红糖样品中AM添加测定

2.6 实际样品测定

分别对云南、广西、广东、江苏4个国内主要的红糖生产地区在售的3种不同红糖，以及从2个国家进口的红糖，共14批次样品进行丙烯酰胺含量检测，检测结果见图8。显然，红糖中丙烯酰胺的含量跨度较大，从25～960 μg/kg不等，多分布在500 μg/kg附近，其中2个有机红糖丙烯酰胺含量较低，分别为25.4 μg/kg和30.2 μg/kg。

图8 红糖样品中丙烯酰胺含量

3 结论

本文通过DB-Heavywax毛细管柱分离，建立了使用单四极杆质谱仪选择离子监控模式检测红糖中丙烯酰胺含量的方法。采用单因素实验与响应面实验，确定溴化反应的最佳条件为10%浓硫酸加入量为8 mL，反应温度为4 ℃，反应时间为40 min，并选择以乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅胶PSA+C18作为吸附剂填料对溴化反应后样品进行净化。该方法操作简单，具有较高的回收率和较好的重复性，能够满足红糖中丙烯酰胺含量的测定要求，符合日常监督和检测要求，为红糖类食品的质量监管提供了技术支持。