利多卡因通过LncRNA H19/miR-671-5p 分子轴调控胃癌细胞增殖、迁移及侵袭

2022-08-30谢玉海朵海珍王学军青海红十字医院麻醉科西宁810000

中国免疫学杂志 2022年12期

谢玉海朵海珍王学军（青海红十字医院麻醉科，西宁 810000）

胃癌是临床常见的一种恶性肿瘤，其高度的侵袭性及转移能力可提高患者病死率。目前临床主要采用手术等方式进行治疗，但大部分患者确诊时已处于肿瘤晚期，若采用手术、化疗等姑息治疗，患者会出现胃癌转移、耐药性等现象，导致治疗失败，研究表明麻醉药物可用于治疗胃癌并可能改善患者临床症状［1-2］。但麻醉药物在胃癌治疗中的作用机制尚未完全阐明。长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）可充当微小RNA（miRNA）的竞争性内源RNA 从而参与胃癌的发生及发展过程［3］。因而需要探究麻醉药物是否通过调控LncRNA表达从而影响胃癌的发生及发展。利多卡因可抑制乳腺癌细胞迁移［4］。LncRNA H19 在卵巢癌细胞中表达上调，并可促进卵巢癌细胞的迁移及顺铂耐药性的发生［5］。生物信息学分析显示miR-671-5p可能是H19 的靶基因，研究表明miR-671-5p 在胃癌细胞中表达下调，并可通过靶向URGCP抑制胃癌细胞增殖并促进细胞凋亡［6］。因此，本研究主要探讨利多卡因对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，探究其对H19/miR-671-5p 分子轴的靶向调控作用，旨在为进一步阐释利多卡因治疗胃癌的分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料利多卡因购自山东华鲁制药有限公司（国药准字：H80110255）；胃癌细胞AGS 购自美国ATCC细胞库；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；miR-671-5p mimics、miR-NC、si-H19、si-NC 购自上海吉玛制药技术有限公司；pcDNA3.1 购自上海柯雷生物科技有限公司；Trizol试剂购自北京全式金生物技术有限公司；反转录与实时荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；MTT、DMSO 购自美国Sigma公司；Transwell小室购自美国Corning 公司；Matrigel 基质胶购自美国 BD 公司；兔抗人Ki-67、PCNA 抗体购自美国CST 公司；兔抗人E-cadherin、N-cadherin 抗体购自美国 Santa Cruz 公司；HRP标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 AGS 细胞接种于96 孔板（3×104个/孔），分别使用不同浓度（10、50、100 μmol/L）的利多卡因处理 24 h［7］，分别记作利多卡因-L 组、利多卡因-M组、利多卡因-H组。同时将正常培养的细胞作为Con 组。参照Lipofectamine2000 说明书进行转染，分别将 pcDNA、pcDNA-H19 转染至 AGS 细胞，随后使用含100 μmol/L 的利多卡因处理24 h，分别记作利多卡因-H+pcDNA 组、利多卡因-H+pcDNAH19组。

1.2.2 MTT 检测细胞增殖取对数生长期AGS 细胞（3×105个/ml）按照每孔100 μl的密度接种于96孔板后加入20 μl MTT 溶液，室温孵育4 h 后弃上清，加入150 μl DMSO，室温振荡孵育10 min，酶标仪检测波长490 nm处各孔吸光度值（OD）。

1.2.3 Transwell 实验检测细胞迁移与侵袭 AGS细胞（5×104个/ml）以200 μl/孔接种于Transwell 小室的上室，继续培养24 h后加入多聚甲醛固定20 min，PBS 洗涤，0.1%结晶紫染液染色10 min，棉签擦拭未迁移的细胞，显微镜下观察迁移细胞数。预冷培养液稀释Matrigel 基质胶后加入上室（40 μl/孔），将其放入培养箱内孵育5 h 后加入AGS 细胞，后续实验步骤同细胞迁移实验，观察侵袭细胞数。

1.2.4 qRT-PCR 检测细胞中 H19、miR-671-5p 的表达水平收集各组处于对数生长期的AGS 细胞，Trizol 法提取细胞中的总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA 浓度。参照反转录试剂盒将总RNA 反转录为cDNA。以cDNA 为模板进行qRT-PCR 反应，参照实时荧光定量PCR 试剂盒配置反应体系及设置反应程序，应用罗氏LightCycler480 荧光定量 PCR 仪检测 H19、miR-671-5p 的相对表达量。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测H19 的靶基因starBase 预测显示 H19 与 miR-671-5p 存在结合位点，构建野生型载体WT-H19、突变型载体MUT-H19后，分别与 miR-NC、miR-671-5p mimics 共转染至AGS细胞，继续培养24 h后检测相对荧光素酶活性。

1.2.6 Western blot 检测 Ki-67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表达 AGS 细胞加入 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，SDS-PAGE 分离蛋白后转移至PVDF膜，封闭，分别加入一抗稀释液（1∶1 000），4 ℃孵育24 h 后使用TBST 洗涤，分别加入二抗稀释液（1∶5 000），室温孵育 1 h 后使用 TBST 洗涤，滴加ECL，暗室内曝光显影，应用Image J 软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理采用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料以表示，数据进行正态分布检验及组间方差齐性检验，符合正态分布及方差齐性，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 利多卡因对胃癌细胞AGS 增殖的影响与Con 组相比，利多卡因-L 组、利多卡因-M 组、利多卡因-H 组细胞活力显著降低（P＜0.05），Ki-67、PCNA蛋白水平显著降低（P＜0.05），且利多卡因-L 组、利多卡因-M 组、利多卡因-H 组细胞活力、Ki-67、PCNA蛋白水平比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1、表1。

表1 利多卡因对胃癌细胞AGS增殖的影响（，n=9）Tab.1 Effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with Lidocaine-L group，2）P＜0.05；compared with Lidocaine-M group，3）P＜0.05.

PCNA 0.98±0.15 0.71±0.131）0.50±0.151）2）0.25±0.061）2）3）52.873 0.000 Groups Con Lidocaine-L Lidocaine-M Lidocaine-H F P Cell viability/%100.23±13.25 76.35±20.301）50.21±16.581）2）30.16±11.151）2）3）34.050 0.000 Ki-67 1.01±0.25 0.75±0.161）0.53±0.111）2）0.30±0.081）2）3）31.123 0.000

图1 利多卡因对AGS细胞Ki-67、PCNA蛋白表达的影响Fig.1 Effects of lidocaine on protein expressions of Ki-67 and PCNA in AGS cells

2.2 利多卡因对胃癌细胞AGS 迁移及侵袭的影响与Con 组相比，利多卡因-L 组、利多卡因-M 组、利多卡因-H 组迁移细胞数及侵袭细胞数显著减少（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平显著升高（P＜0.05），N-cadherin 蛋白水平显著降低（P＜0.05），且利多卡因-L组、利多卡因-M组、利多卡因-H组迁移细胞数、侵袭细胞数及E-cadherin、N-cadherin 蛋白水平比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2、表2。

表2 利多卡因对胃癌细胞AGS迁移及侵袭的影响（，n=9）Tab.2 Effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with Lidocaine-L group，2）P＜0.05；compared with Lidocaine-M group，3）P＜0.05.

N-cadherin 1.01±0.16 0.72±0.111）0.53±0.121）2）0.28±0.041）2）3）63.665 0.000 Groups Con Lidocaine-L Lidocaine-M Lidocaine-H F P Number of migration cells 125.24±16.32 92.31±12.241）63.22±11.251）2）36.32±10.021）2）3）81.830 0.000 Number of invasion cells 97.65±11.26 70.32±13.241）51.26±15.231）2）31.24±10.051）2）3）45.354 0.000 E-cadherin 0.52±0.13 0.78±0.111）0.92±0.131）2）1.05±0.081）2）3）35.444 0.000

图2 利多卡因对 AGS 细胞 E-cadherin、N-cadherin 蛋白表达的影响Fig.2 Effects of lidocaine on expressions of E-cadherin and N-cadherin protein in AGS cells

2.3 利多卡因对胃癌细胞AGS 中H19、miR-671-5p表达量的影响与Con组相比，利多卡因-L组、利多卡因-M组、利多卡因-H组细胞中H19表达显著降低（P＜0.05），miR-671-5p 表达显著升高（P＜0.05），且利多卡因-L 组、利多卡因-M 组、利多卡因-H 组细胞中H19、miR-671-5p 的表达量比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 利多卡因对胃癌细胞AGS中H19、miR-671-5p表达的影响（，n=9）Tab.3 Effect of lidocaine on expressions of H19 and miR-671-5p in gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with Lidocaine-L group，2）P＜0.05；compared with Lidocaine-M group，3）P＜0.05.

miR-671-5p 1.00±0.12 1.65±0.131）2.52±0.201）2）3.02±0.241）2）3）225.689 0.000 Groups Con Lidocaine-L Lidocaine-M Lidocaine-H F P H19 1.01±0.13 0.71±0.111）0.52±0.121）2）0.30±0.091）2）3）63.309 0.000

2.4 H19 靶向调控miR-671-5p starBase 预测显示H19 的序列中含有与miR-671-5p 互补的核苷酸序列，见图3。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染野生型载体WT-H19 的细胞实验中，与miR-NC 组相比，miR-671-5p 组荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；共突变型载体MUT-H19的细胞实验中，miR-671-5p 组荧光素酶活性与miR-NC 组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。与si-NC组相比，si-H19组细胞中miR-671-5p 表达水平显著升高（P＜0.05）；与 pcDNA 组相比，pcDNA-H19 组细胞中 miR-671-5p表达水平显著降低（P＜0.05），见表5。

表4 双荧光素酶报告实验（，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

MUT-H19 1.01±0.21 1.03±0.11 0.253 0.803 Groups miR-NC miR-671-5p t p WT-H19 1.03±0.15 0.63±0.111）6.451 0.000

表5 H19靶向调控miR-671-5p的表达（，n=9）Tab.5 H19 target regulate expression of miR-671-5p（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with pcDNA group，2）P＜0.05.

miR-671-5p 1.00±0.21 2.35±0.321）1.02±0.16 0.32±0.082）145.632 0.000 si-NC si-H19 pcDNA pcDNA-H19 F P Groups

图3 H19的序列中含有与miR-671-5p互补的核苷酸序列Fig.3 Sequence of H19 contains a nucleotide sequence complementary to miR-671-5p

2.5 H19 过表达减弱利多卡因对胃癌细胞AGS 增殖的抑制作用与利多卡因-H+pcDNA 组相比，利多卡因-H+pcDNA-H19 组细胞活力显著升高（P＜0.05），Ki-67、PCNA 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图4、表6。

表6 H19过表达减弱利多卡因对胃癌细胞AGS增殖的抑制作用（，n=9）Tab.6 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Lidocaine-H+pcDNA group，1）P＜0.05。

PCNA 0.27±0.07 0.92±0.181）10.097 0.000 Groups Lidocaine-H+pcDNA Lidocaine-H+pcDNA-H19 t P H19 0.31±0.08 1.32±0.121）21.009 0.000 miR-671-5p 3.01±0.18 1.15±0.161）23.170 0.000 Cell viability/%31.21±10.03 96.32±11.241）12.966 0.000 Ki-67 0.26±0.03 0.85±0.111）15.524 0.000

图4 Western blot检测Ki-67、PCNA蛋白表达Fig.4 Western blot was used to detect expressions of Ki-67 and PCNA protein

2.6 H19 过表达减弱利多卡因对胃癌细胞AGS 迁移及侵袭的抑制作用与利多卡因-H+pcDNA 组相比，利多卡因-H+pcDNA-H19 组迁移细胞数及侵袭细胞数显著增多（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平显著降低（P＜0.05），N-cadherin 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图5、表7。

图5 Western blot检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达Fig.5 Western blot was used to detect expressions of E-cadherin and N-cadherin protein

表7 H19过表达减弱利多卡因对胃癌细胞AGS迁移及侵袭的抑制作用（，n=9）Tab.7 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Lidocaine-H+pcDNA group，1）P＜0.05.

N-cadherin 0.29±0.06 0.78±0.131）10.267 0.000 Groups Lidocaine-H+pcDNA Lidocaine-H+pcDNA-H19 t p Number of migrating cells 39.32±10.12 98.65±13.241）10.681 0.000 Number of invasion cells 31.58±10.11 85.42±11.291）10.658 0.000 E-cadherin 1.03±0.05 0.56±0.111）11.669 0.000

3 讨论

利多卡因可通过调节LncRNA-MEG3/miR-421/BTG1 分子轴抑制宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡［8］；通过调节miR-539/EGFR 分子轴抑制肺癌细胞的增殖和转移［9］；通过上调 miR-145 表达抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭［10］。本研究结果显示，不同浓度的利多卡因处理后胃癌细胞活力显著降低，提示利多卡因可抑制胃癌细胞增殖。上皮-间质转化（EMT）与肿瘤细胞迁移及侵袭密切相关，其中上皮型标志物为E-cadherin，E-cadherin 表达下调可促进EMT 的发生从而促进肿瘤细胞转移，间充质细胞标志物N-cadherin表达下调可抑制EMT的发生从而抑制肿瘤细胞转移［11］。本研究结果显示，不同浓度的利多卡因处理后胃癌细胞迁移及侵袭能力显著降低，E-cadherin 表达上调，N-cadherin 表达下调，且呈利多卡因剂量依赖性，提示利多卡因可抑制胃癌细胞的迁移及侵袭。

H19在胃癌细胞中表达水平升高并可促进细胞生长［12］；在多发性骨髓瘤细胞中表达上调并可通过激活BRD4 信号通路促进多发性骨髓瘤发生［13］。miR-671-5p在胃癌细胞中表达下调，circPIP5K1A可充当miR-671-5p 的海绵分子从而促进胃癌的发展进程［14］。本研究通过双荧光素酶报告实验证实H19可靶向结合miR-671-5p。本研究结果显示，不同浓度的利多卡因处理后胃癌细胞中H19 表达下调，而miR-671-5p 表达上调，且呈利多卡因剂量依赖性，而H19 过表达可减弱利多卡因对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。

综上所述，利多卡因可抑制胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭，其可能是通过下调H19 表达及上调miR-671-5p 表达发挥作用，可为进一步揭示利多卡因抗胃癌的作用机制提高理论依据，并可为胃癌的治疗提供新方向。