秋水仙碱通过调控Bcl-2/Cleaved-caspase3细胞凋亡途径改善异丙肾上腺素所致小鼠心肌损伤

董 兰，丁瑞雪，唐文静，李叶丽，李意奇，杨丹莉

(1.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563099)

细胞凋亡为细胞程序性死亡，能维持机体内环境稳态。成年心肌细胞是“永久性细胞”，过多的心肌细胞凋亡会影响心脏的结构与功能[1]。在缺血缺氧、感染等刺激下，心肌细胞发生坏死、凋亡、心肌受损，诱发心室重构，甚至心力衰竭，故抑制心肌细胞凋亡可减轻心肌组织损伤[2]。目前常把心肌肌钙蛋白I(Cardiac troponin I，cTn I)作为心肌特异性标志蛋白。正常状态下，仅少部分cTn I游离在心肌细胞浆中，当心肌损伤发生时，cTn I从心肌细胞释放至细胞间隙及血液中，故cTn I常作为反映心肌损伤的指标[4]。B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)可抑制细胞凋亡的发生，研究表明，Bcl-2蛋白表达减少，导致心肌细胞凋亡[3]。“细胞凋亡执行者”Caspsase3属于半胱氨酸蛋白水解酶家族，其被激活后经剪切分离成活化型的Caspsase3(Cleaved-caspase3)，引发细胞凋亡[5]。

秋水仙碱(Colchicine，Col)是临床治疗痛风和家族性地中海热的经典药物，也是治疗心包炎的重要药物[6]。研究发现小剂量服用秋水仙碱有助于冠心病的治疗，并降低心肌梗死的发生率[7-8]。异丙肾上腺素(Isoproterenol，ISO)是一个经典的非选择性β受体激动药物，研究表明，ISO能够诱导心肌细胞凋亡等心肌损伤[9-10]。Col对ISO诱导的小鼠心肌损伤是否具有保护作用尚不清楚。故本项目旨在研究Col对ISO所致小鼠心肌损伤的干预效应，并初步探讨其机制。

1 材料

1.1 动物 从长沙市天勤生物技术有限公司购入18只7周龄雄性C57BL/6小鼠，SPF级，许可证号：SCXK(湘)2019-0014。

1.2 药品与试剂 秋水仙碱片(批准文号：国药准字H53021369，西双版纳版纳药业有限责任公司)；ISO(货号：HYB0468，MCE公司)；一步法Tunnel细胞凋亡检测试剂盒(货号：C1088，碧云天生物技术有限公司)；GAPDH兔多克隆抗体(货号：10494-1-AP，Proteintech公司)；Bcl-2兔多克隆抗体(货号：D154033-0100，BBI Life Sciences公司)；cTnI兔单克隆抗体(货号：ab209809，abcam公司)；Caspase3兔多克隆抗体(货号：19677-1-AP，Proteintech公司)；Cleaved-caspase3多克隆抗体(货号：9661，Cell Signaling Technology公司)；HRP标记山羊抗兔IgG(货号：S0001，Affinity公司)。

1.3 仪器 RM2245组织切片机(德国LeicaBiosystems公司)；Mini-PROTEAN3电泳仪；MultisKan GO全波长酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；Mini Trans-Blot Turbo转印系统、Olympus光学显微镜(日本Olympus 公司)；Chemi Doc 化学发光凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药 18只7周龄雄性C57BL/6小鼠于SPF级动物房(室内温度为21～26 ℃，相对湿度为40%～70%)适应性喂养1周后，随机分为空白对照组(Control)、模型组(ISO，5 mg/kg)、秋水仙碱组(Col，1 mg/kg)，每组6只。ISO、Col组小鼠经颈背部皮下注射ISO，每天1次，连续14 d，建立心肌损伤模型[11]，Control组给予等体积的生理盐水。Col组按剂量灌胃Col，对照组与ISO组给予等体积双蒸水，每天1次，连续14 d。14 d后，称取小鼠体重并记录，腹腔注射2%戊巴比妥钠(4 mg/kg)麻醉小鼠，取出心脏，称取全心质量，计算HMI。HMI=心脏重量(mg)/小鼠体重(g)。

2.2 H&E染色检测小鼠左心室组织病理变化 小鼠的左心室组织经10%中性甲醛固定48 h、脱水、石蜡包埋等步骤后，利用组织切片机制备成3 μm切片，H&E染色后，中性树脂封片，在正置显微镜下观察小鼠左心室组织的病理变化情况。

2.3 Tunnel染色检测小鼠左心室组织心肌细胞凋亡情况 小鼠左心室组织石蜡切片常规脱蜡后，滴加蛋白酶K溶液，于37℃孵箱中反应20 min；用TBST溶液清洗切片，滴加Tunnel反应液，于37 ℃孵箱中反应60 min；清洗切片后，滴加DAPI溶液，常温条件反应8 min。待切片干燥后用抗荧光猝灭剂封片，在正置荧光显微镜下观察小鼠左心室组织心肌细胞凋亡情况。利用Image J软件对细胞计数，心肌细胞细胞核呈蓝色荧光，蓝、绿色荧光重合的细胞为心肌凋亡阳性细胞，计算心肌细胞凋亡率。心肌细胞凋亡率=心肌凋亡阳性细胞/心肌细胞×100 %。

2.4 Western blot检测小鼠左心室组织中cTnI、Bcl-2、Cleaved-caspase3蛋白水平的变化情况 称取50 mg小鼠左心室组织剪碎，加入500 μL的裂解液(PMSF∶RIPA：磷酸酶抑制剂=1∶100∶1)，置于冰上裂解30 min后，4℃条件下，台式离心机(转速：12 000 rpm)，离心15 min，吸取上清液，利用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度后，配制10 μL蛋白样本(蛋白浓度：30 μg/10 μL)的体系。蛋白样本经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用Trans-Blot Turbo Cassette进行转膜，8%的脱脂奶粉溶液封闭2.5 h，TBST洗膜后，将膜置于配制好的一抗溶液中：GAPDH(1∶5 000)、Bcl-2(1∶5 000)、cTnI(1∶2 500)、Caspase 3(1∶800)、Cleaved-caspase3(1∶800)，4 ℃孵育16～22 h，用TBST洗膜后，4 ℃条件下孵育二抗溶液(1∶5 000)1 h，经TBST洗膜后，配制高敏ECL发光试剂进行显色，利用Chemi Doc化学发光凝胶成像系统获取图像，并用Image Lab软件对蛋白条带的灰度值进行分析。

3 结果

3.1 小鼠的一般状况 与Control组相比，ISO组毛发晦暗，状态萎靡。与ISO组相比，Col组小鼠毛发光泽，状态较活泼。

3.2 小鼠心脏质量指数(HMI)的变化 与Control相比，ISO组HMI升高(P<0.05)。与ISO组相比，Col组HMI降低(P<0.05，见图1)。

3.3 小鼠左心室组织病理变化 H&E染色结果显示，Control组心肌细胞排列整齐，无明显的炎性浸润；与Control组相比，ISO组心肌细胞排列紊乱，心肌细胞肥大，炎性浸润严重；与ISO组相比，Col组心肌细胞排列趋于整齐，心肌细胞肥大、炎性浸润得到明显改善(见图2)。

3.4 小鼠左心室心肌细胞的凋亡情况 Tunnel染色结果显示，与Control组相比，ISO组心肌细胞凋亡率升高了近5倍(P<0.05)；与ISO组相比，Col组心肌细胞凋亡率降低了约82.70 %(P<0.05，见图3)。

3.5 小鼠左心室组织中cTnI的蛋白表达情况 Western blot检测结果显示，与Control组相比，ISO组左心室组织中cTnI蛋白的表达增加了23.04%(P<0.05)；给予Col后，Col组左心室组织中cTnI蛋白的表达减少了19.86%(P<0.05，见图4)。提示Col可改善ISO引起的心肌细胞损伤。

3.6 左心室组织中Bcl-2的表达情况 Western blot检测结果显示，与Control组相比，ISO组左心室组织中Bcl-2蛋白的表达减少了27.12%(P<0.05)；给予Col后，Col组左心室组织中Bcl-2蛋白的表达增加了24.04%(P<0.05，见图5)。

3.7 左心室组织中Cleaved-caspase3的表达情况 Western blot检测结果显示，与Control组相比，ISO组左心室组织中Cleaved-caspase3蛋白的表达增加了18.20%(P<0.05)；给予Col后，Col组左心室组织中Cleaved-caspase3蛋白的表达减少27.80%(P<0.05,见图6)。

4 讨论

心肌损伤能诱导心肌细胞凋亡，过多的心肌细胞凋亡是引起心脏功能紊乱以及结构改变的重要因素[12]。ISO可导致动物心肌缺血、缺氧，引起心肌细胞凋亡等[13]。cTn I是评价心肌损伤的重要指标。本研究结果发现，与正常对照组相比，ISO模型小鼠心脏质量指数明显增加；左心室心肌细胞排列紊乱，心肌细胞肥大，并伴有炎性浸润；cTn I蛋白水平明显上调，表明ISO成功诱导小鼠心肌损伤的发生。给予Col后，小鼠心脏质量指数降低，左心室心肌细胞排列趋于整齐；心肌细胞形态、炎性浸润得到明显改善，且左心室组织的cTn I蛋白水平明显降低，提示Col可减轻ISO诱导的心肌损伤。Tunnel染色是评价细胞凋亡的经典方法。在凋亡的细胞中，DNA内切酶被激活，将核小体间的基因组DNA切断为180～200 bp的DNA片段，DNA片段暴露出的3′-OH可在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)的催化下与绿色荧光探针荧光素标记的脱氧尿嘧啶(dUTP)结合，导致凋亡细胞呈绿色荧光。正常细胞较少发生DNA断裂。在正置荧光显微镜下根据绿色荧光细胞数量的多少，可观察各组心肌细胞凋亡的情况。本研究通过Tunnel染色发现：ISO组心肌细胞凋亡数量明显增加，给予Col后，心肌细胞凋亡数量明显下降，提示Col能明显改善ISO诱导的心肌细胞凋亡。

Bcl-2属于抗凋亡蛋白，其结构包括C端结构域以及Bcl-2同源结构域(Bcl-2 homology，BH)1-4。Bcl-2可通过C端结构域定位于线粒体、内质网等外膜，BH1、BH2、BH3能够形成疏水凹槽，促进Bcl-2二聚化，发挥抗细胞凋亡作用[3]。研究表明，Bcl-2蛋白水平降低，抗凋亡作用减弱，引发心肌细胞凋亡，导致心肌细胞损伤[14]。心肌细胞凋亡途径的精密调控离不开Caspase家族，它们在心肌细胞的凋亡过程中分工明确，包括起始型Caspase、效应型Caspase等。Caspase3属于效应型Caspase，Caspase3被激活后经切割分离为Cleaved-caspase3，可促进细胞凋亡小体的形成，导致心肌细胞凋亡[15]。研究发现，Bcl-2可调节线粒体膜通透性，引发Caspase级联反应，导致心肌细胞凋亡[16]。本研究结果显示，与Control组相比，ISO组Bcl-2蛋白水平下调，Cleaved-caspase3蛋白水平上调，给予Col后，Bcl-2蛋白水平上调，Cleaved-caspase3蛋白水平下调。以上结果提示：Col可通过上调Bcl-2蛋白水平，下调Cleaved-caspase3蛋白水平，减轻ISO导致的心肌细胞凋亡。

综上所述，Col能改善ISO所致心肌损伤，其机制至少与其上调Bcl-2蛋白的表达，抑制Cleaved-caspase3的激活，减少心肌细胞凋亡相关。