食管癌患者miR-106b表达意义及与预后的关系

杨景滟，陈 静，王利琼

(1.川北医学院附属医院 检验科，四川 南充 637000；2.四川大学华西医院广安医院 消化内科，四川 广安 638500)

食管癌是全球常见的一种肿瘤疾病，死亡率较高，2014年全球新发食管癌患者约45.6万例，因食管癌死亡者约40万例，在恶性肿瘤中发病率位居第8位，死亡率位居第6位[1]。2015年我国新发食管癌病例超过24万，因食管癌死亡患者超过18万[2]，总体预后欠佳。为了尽早对食管癌进行诊疗，改善患者预后，探索与之相关的靶标基因很有必要。研究表明微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)参与了细胞增殖、凋亡、侵袭、分化等过程，它与肿瘤疾病密切相关，可通过不同途径发挥抑癌或促癌作用[3]。有学者指出miR-106b参与了肿瘤疾病发生与进展过程，它在子宫内膜癌组织中呈高表达，且其过表达与癌细胞迁移、组织分化程度有关[4]。杨林声等[5]研究提示视网膜母细胞瘤患者的癌组织中miR-106b表达上调，其能增强这类癌细胞增殖能力。而李元梅等[6]则发现甲状腺癌组织中miR-106b表达较癌旁组织降低，其过表达能促进癌细胞凋亡。这表明miR-106b在肿瘤中的作用机制比较复杂，在不同肿瘤中可能发挥不同生物学功能。基于此，本研究选取139例食管癌患者进行研究，分析miR-106b在这类癌组织中的表达情况，并探讨其对预后的影响，以便提高食管癌诊疗的及时性与有效性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2016年5月至2019年5月收治的139例食管癌患者为研究对象。本次纳入样本通过优效性检验样本量予以计算，参考相关文献[7]报道及前期工作基础，本次至少需要120例样本，故纳入160例患者，因受纳入以及排除标准限制，最终有139例符合要求。纳入标准：经病理诊断证实为食管癌患者，且年龄≥18岁；近6个月内无大手术史者；既往无放疗、化疗、免疫治疗史者；首诊患者；完全知晓研究内容，并签署同意书者。排除标准：复发性食管癌者；患严重脑血管、心血管等其他危及生命的疾病者；就诊时有慢性或急性感染者；患其它原发性肿瘤者；有自身免疫性病史者。在139例患者中，男76例，女63例，年龄32～74岁，平均(58.32±10.45)岁；临床分期：I期38例，II期52例，III期49例；肿瘤直径：≥5 cm 61例，<5 cm 78例；分化程度：低分化59例，中高分化80例；淋巴结转移：有43例，无96例；大体分型：溃疡型53例，膨出型25例，髓质型33例，其它28例。研究方案获本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 miR-106b检测 采用实时逆转录聚合酶链反应法(Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测食管癌、癌旁组织(距癌边缘3cm)中miR-106b表达水平，主要仪器包括超低温冰箱(海尔集团，BCD-176TS型)、高速离心机(湘仪集团，TG16-WS型)、凝胶图像分析系统(北京六一生物科技有限公司，WD-9413B型)、实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司，7500型)。主要试剂为Trizol试剂、逆转录试剂、异丙醇、琼脂糖，购自北京全式金生物公司。具体如下：(1)提取总RNA：待获取组织样本后，置于冻存管内，并放置在液氮环境下备用。取出样本，置于无菌EP管内，取1 mL Trizol试剂加入，混匀，室温下反应5 min。取200 μL氯仿加入，混匀，室温下反应10 min，4 ℃下离心15 min(12 000 rpm)。吸取上层水相，并移至新EP管内，做好标记。取500 μL异丙醇置于新EP管内，混匀，在室温下反应10 min，4 ℃下离心15 min(12 000 rpm)，弃上清。取500 μL 70%乙醇加入，4℃下离心8 min(8 000 rpm)，弃上清。取DEPC水40 μL加入促进溶解，存放至-80 ℃环境下备用，并留取少量样本检测RNA浓度与纯度。(2)逆转录与PCR检测：经反转录试剂对总RNA行逆转录，合成cDNA，并行PCR检测，反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸31 s，40个循环。上、下游引物序列：①miR-106b分别为5′-TGCGGCAACACCAGTCGATGG-3′、5′-CCAGTGCAGGGTC CGAGGT-3′；②内参引物U6：5′-TGCGGGTGCTCG CTTCGGCAGC-3′、5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。经2-△△CT表示miR-106b表达水平。

1.2.2 随访分析 在患者术后随访24个月，随访方式根据患者实际情况而定，包括微信随访、电话随访、门诊随访等，分析患者的2年累积生存率。累积生存情况即以患者术后第1天作为随访起始日，以随访结束为截止日，记录该期间的累积生存人数，生存率即T时刻仍存活例数/总病例数。

2 结果

2.1 食管癌、癌旁组织中miR-106b表达量及其对食管癌的诊断价值 食管癌组织中miR-106b表达量为(56.74±12.32)，低于癌旁组织的(221.54±56.52)(t=33.588，P<0.05)，见图1。miR-106b表达量诊断食管癌的AUC为0.758，(标准误：0.029，P=0.000，95%CI：0.701～0.816)，最佳界值为138.080，敏感度为80.00%，特异度为60.90%，ROC曲线见图2。

图1 食管癌、癌旁组织中miR-106b的相对表达量

2.2 miR-106b表达与食管癌病理特征的关系 根据食管癌患者癌组织中miR-106b表达均值分成高表达组(n=75，≥均值)、低表达组(n=64，<均值)。miR-106b低表达组临床分期III期、肿瘤直径≥5 cm、肿瘤低分化、淋巴结转移占比高于高表达组(P<0.05)，两组性别、年龄、大体分型比较无差异(P>0.05)，见表1。

表1 miR-106b表达与食管癌病理特征的关系[n(%)]

2.3 食管癌患者生存、死亡情况及预后危险因素分析 通过随访24个月，提示139例患者生存107例，死亡32例。以表2中各变量作为自变量X，以预后为因变量Y(生存=0，死亡=1)，COX多因素回归性分析提示临床分期III期、肿瘤直径≥5 cm、肿瘤低分化、淋巴结转移、miR-106b低表达是预后危险因素，术后放/化疗是预后保护因素(P<0.05，见表2)。

表2 食管癌患者预后的COX多元回归性分析

2.4 不同miR-106b表达患者的2年累积生存情况分析 通过随访分析提示，miR-106b高表达组2年累积生存率为86.67%(65/75)，miR-106b低表达组2年累积生存率为65.63%(42/64)。miR-106b低表达组2年累积生存率低于高表达组(log-rankx2=8.628，P<0.05，见图3)。

图3 不同miR-106b表达患者2年累积生存函数

3 讨论

食管癌发病原因复杂，包括吸烟史、饮食习惯、遗传、生活习惯、免疫功能低下等，近年来，随着食管癌诊断技术的进展，其检出率逐年增高，但预后仍不够理想[8]。研究表明miRNAs与肿瘤发生存在密切关联，它参与了多种肿瘤疾病的调控，例如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、肠癌等，在这类疾病中具有促癌或抑癌基因作用，对癌症早期诊疗有重要意义[9]。通过寻求与食管癌相关的miRNAs，可能为该病早期诊断与治疗提供依据。目前，研究指出miR-106b与肿瘤发生有关，它介导的还原性磷酸酶与张力蛋白同源物可能通过调节磷脂酰肌醇3激酶/Akt通路，参与乳腺癌进展[10]。Xu等[11]发现miR-106b抑制剂能促进肝癌细胞凋亡，提高肝细胞癌治疗的敏感性。Sun等[12]研究则提示miR-106b能通过靶向残疾基因同源物，对肝癌细胞的侵袭、增殖与转移进行调节。这表明miR-106b与多种恶性肿瘤发病、进展过程有关，基于此，临床有必要进一步明确miR-106b与食管癌及其预后的关系，为该病诊断与治疗提供可靠信息。

本次结果显示，与癌旁组织相比，食管癌组织中miR-106b表达量下调，其对食管癌诊断有一定价值，表明miR-106b与食管癌发生可能有关联。miR-106b是miR-106b-25基因簇的重要成员，既往研究发现其在多种恶性肿瘤组织内呈过表达，与肿瘤新生血管形成、细胞增殖有关[13-14]。随着临床研究进展，有学者指出甲状腺癌组织中miR-106b表达较癌旁组织下调[15]。这表明miR-106b的生物功能多样化，可能在不同肿瘤中发挥的作用具有差异。Jiao等[16]发现miR-106b高表达能下调Zbtb7a，从而提高胆管癌患者5-氟尿嘧啶化疗的敏感性，而低表达的miR-106b与胆管癌预后不良有关，表明miR-106b过表达可能发挥抑癌作用。上述均为本研究结论给予了支持，本次研究通过进一步分析显示食管癌患者miR-106b表达与肿瘤分期、肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移有关。miR-106在食管癌组织内表达降低，低表达的miR-106可导致其对癌细胞增殖、侵袭的抑制作用减弱，有利于肿瘤生长，提高恶化程度，增加淋巴结转移风险。

食管癌早期缺乏典型症状，易被忽视，多数病人就诊时已进展成中期或晚期，治疗难度大，预后非常差[17]。宋春洋等[18]发现临床分期、术后辅助治疗等因素与食管癌手术患者的预后有关。本次结果提示食管癌患者预后与临床分期、肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移有关，这些因素在既往研究[19]中已基本得到证实。本次研究还发现miR-106b高表达是食管癌预后的危险因素之一，且其过表达能降低2年累积生存率。通过前面的分析已发现miR-106b在食管癌组织中呈低表达，低表达的miR-106b可能通过促进癌细胞增殖，导致肿瘤进一步恶化，加重病情，从而影响预后。Hoshino等[20]研究显示食管鳞癌组织中miR-106b表达降低，与本次结论吻合，该研究认为食管鳞癌患者miR-106b表达降低的原因可能为miR-106b靶基因增高，促使组织内miR-106b消耗增加，导致其表达下调，但研究中尚未明确miR-106b与食管鳞癌病理特点及预后的具体关系，本研究则对此进行了阐述，且通过COX多元回归分析与生存曲线证实miR-106b与食管癌预后有关。韩东等[21]则发现食管鳞癌组织中miR-106b表达较癌旁组织增高，与本次结论相悖，原因可能比较复杂，也许与纳入患者个体病情差异、免疫功能、既往病史等因素有关。总之，关于miR-106b在食管癌中的作用机制，临床还有待更深入的探索。

综上所述，食管癌组织中miR-106b表达下调，低表达的miR-106b可导致预后不良。本研究局限性为关于miR-106b与食管癌及其预后的关系还处于初步探索阶段，未来还需延长随访时间，更进一步阐述其对食管癌预后的影响。