归芍方对邻苯二甲酸二丁酯诱导的斑马鱼眼部细胞凋亡的影响*

李梦雨，华永庆，黄天一，郑云枫，严国俊，程建明，袁晓琳

(南京中医药大学1.药学院，2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心；3.中医学院中西医结合学院，南京 210023)

视疲劳是指由于各种病因使人眼视物时超过其视觉功能所能承载的负荷，导致用眼后出现视觉障碍、眼部不适或伴有全身症状等以至不能正常进行视作业的一组症候群[1]。随着信息化的发展以及人们生活方式的变化，视疲劳在各年龄群体中颇为常见，严重影响患者的生活质量[2]。过度使用的视觉显示终端及环境污染等因素可引起眼部细胞氧化应激损伤，造成眼部细胞凋亡，导致眼部疾病的产生[3]。中医学认为视疲劳属“肝劳”范畴。临床上根据本病病机肝肾两虚、精血不足的特点，提出补益肝肾、益气活血、通络明目的治疗原则，参照既往治疗视疲劳经验，拟归芍方防治视疲劳。归芍方源于元代倪维德之芎归补血汤及现代陈达夫驻景丸加减方[4-5]，由当归、白芍、川芎、枸杞和菟丝子等5味中药组成，具有补益肝肾的功效，主治肝肾两虚、两目昏暗。临床观察发现归芍方具有较好的缓解视疲劳作用，然而其确切的药理效应尚待证实。

斑马鱼作为研究人类眼科疾病的模型之一[6]，其结构、组织成分和生物信号方面与其他脊椎动物相似，鉴于其实验周期短、胚胎透明、头部眼球占比较大的特点显著优于兔、鼠、恒河猴等动物，已被逐渐应用于眼科相关疾病研究[7]。本研究采用斑马鱼眼部细胞凋亡模型对归芍方在体药理作用进行研究，同时，对可能引起药理活性发生改变的不同提取方法与药理作用间关系进行了研究，并对其作用机制进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 斑马鱼AB品系，购于凯基生物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2018-0004。饲养条件：昼夜节律，昼：夜=14 h：10 h；温度(28.5 ± 0.5) ℃。饲养环境严格按照《江苏省地方标准》实验用斑马鱼饲养技术条件。实验流程严格按照《实验动物管理与使用指南》执行。

1.1.2药品与试剂 药材饮片：当归(产地甘肃，批号：17071705)，炒白芍(产地安徽，批号：17091605)，川芎(产地四川，批号：17101814)，菟丝子(产地内蒙古，批号：17081605)，枸杞子(产地宁夏，批号：17102112)。

提取物：当归提取物(批号：CDG-A-081908)，白芍提取物(批号：CBS-A-091802)，川芎提取物(批号：CCX-A-081109)，菟丝子提取物(批号：CTSZ-A-081118)，枸杞子提取物(批号：CGQ-A-081203)，以上提取物与药材质量比均为1：10，均购于陕西嘉禾生物科技股份有限公司。人参皂苷(ginsenoside，Rg1，含量≥98%，批号：B21057)，邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP；含量> 99.5%，批号：S51140)，链酶蛋白酶E(批号：721J041)、吖啶橙染液均购自上海源叶生物科技有限公司；MS-222(Acros Organics，批号：A0288328)。

1.1.3实验仪器 Leica体式荧光显微镜(Leica公司，型号：M205FA)；生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司，型号：SPX-150)；酶标仪(Bio-Tek公司，型号：SyneRgy2)；凝胶电泳仪(BIO-RAD公司，型号：1658033)；定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(Applied Biosystems公司，型号：7500)。

1.2方法

1.2.1药物溶液的配制 归芍方研究用样品的制备。 ①归芍方组成：当归、炒白芍各10 g，川芎、菟丝子、枸杞子各8 g。②归芍方药材饮片水提取物(Chinese material medicine extract，ME，批号：20180523)：按归芍方，加水提取2次(7倍，5倍)，每次提取1.5 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至含生药量0.1 g·mL-1，即得。③归芍方药材水提醇沉提取物(Chinese material medicine extract alcohol precipitation treatment，MEA，批号：20180523)：按归芍方，加水提取2次(7倍，5倍)，每次提取1.5 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至1 g·mL-1，加乙醇至含醇量60%，放置24 h，滤过，滤液减压浓缩至含生药量0.1 g·mL-1，即得。④归芍方提取物配方(Chinese medicine extract powder solution，PS，批号：20180502)：按归芍方，按比例取各药味提取物，加水制备成含生药量0.1 g·mL-1的溶液，即得。上述归芍方提取物采用高效液相色谱(HPLC)法，对不同提取方式样品中的关键质量指标芍药苷、阿魏酸进行了含量测定，以保证不同提取方式样品的质量相对均一。

胚胎培养液配制：量取纯水1000 mL，加氯化钠溶液调节电导率至550～580 μS·cm-1，然后加入0.1 mg·mL-1亚甲蓝溶液1 mL，混合均匀，即得。

DBP溶液配制：称取适量DBP，加入胚胎培养基混匀，得10 mmol·L-1DBP储备液，使用时稀释至所需浓度即可。

1.2.2存活率检测 将挑选好的正常胚胎置于24孔板中，每孔12枚，分为5组，平行3次，加入胚胎培养基1.5 mL，从受精后30 h开始加入各浓度药物(0，10，102，103，104μg·mL-1)1.5 mL，于给药24 和48 h观察胚胎存活数目，数据汇总后统计存活率。

1.2.3给药方法 参照本课题组前述方法进行[8]，将正常斑马鱼胚胎置于3块6孔板中，给予胚胎培养基2 mL，饲养至受精后30 h，吸尽培养基；正常对照组每孔加入胚胎培养基2 mL，模型对照组每孔加入10 μmol·L-1DBP2 mL，给药组每孔除加入20 μmol·L-1DBP1 mL外分别加入 ME、PS、MEA(200，100和20 μg·mL-1)1 mL，饲养18 h。吖啶橙染色并在体式显微镜下观察眼部凋亡细胞，采集图片并进行数据处理。

1.2.4图片采集及数据处理 将胚胎放入有0.5 mg·mL-1蛋白酶E溶液的培养皿中，在室温下放置8 min；当胚胎有个别开始脱膜时，立即加入胚胎培养液稀释终止脱膜，迅速将脱膜后的胚胎移入干净的培养皿中，漂洗2次后，用5 μg·mL-1吖啶橙在暗室中染色1 h，接着用胚胎培养液漂洗3次，每次5 min，然后用0.04 mg·mL-1MS-222 溶液1 mL 麻醉5 min，置载玻片上于荧光显微镜下镜检摄像，眼部凋亡细胞呈绿色荧光，采用Image J软件对斑马鱼眼部凋亡细胞数进行统计。

1.2.5免疫印迹(Western blotting)法检测凋亡相关基因Bcl-2蛋白的表达量 收集给药结束后斑马鱼胚胎，提取蛋白，二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA) 法测定蛋白浓度。免疫印迹法测定Bcl-2蛋白的表达量。Bcl-2一抗(稀释比例1：1000)，4 ℃孵育过夜。常温摇床孵育兔二抗1 h，于数字化凝胶成像工作站曝光，Image Lab灰度值统计分析，根据凝胶成像结果检测Bcl-2蛋白表达量。

1.2.6实时荧光定量PCR检测线粒体mtDNA 拷贝数的变化 本实验选择线粒体mtDNA上的mt-cytb作为目的基因，单拷贝基因核基因GAPDH作为内参。所使用的引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列 Tab.1 Sequences of primers

收集给药结束后斑马鱼，漂洗结束后将幼鱼分组吸入无酶EP管中，按照DNA快速抽提试剂盒说明书提取总DNA，稀释DNA样本至终浓度20 ng·μL-1。然后使用实时荧光定量PCR仪对线粒体mtDNA上的mt-cytb基因以及单拷贝核基因GAPDH进行定量，每组各3 个平行样本。反应结束后通过溶解曲线分析确定产物的特异性。采用2- ΔΔCt对PCR结果进行相对定量分析。其中线粒体DNA拷贝数(mitochondrial DNA copy number，mtDNAcn)表示为mt-cytb基因与GAPDH基因表达的相对比值。

2 结果

2.1不同制备工艺归芍方对斑马鱼存活率的影响 归芍方不同提取物对斑马鱼存活率的影响，结果见图1。给药24 h后，104μg·mL-1MEA、PS显著降低斑马鱼胚胎存活率(P<0.01)；给药时间延长至48 h后，104μg·mL-1ME及103μg·mL-1PS开始表现出明显的胚胎致死性(P<0.01)。其余浓度药物给药24 及48 h对胚胎存活率无显著影响。

2.2不同制备工艺归芍方对斑马鱼眼部细胞凋亡的影响 结合存活率实验结果，采用无显著影响的100 μg·mL-1及其以下浓度的归芍方提取物来探究对斑马鱼眼部细胞凋亡的影响。在受精后30 h的斑马鱼培养基中加入10 μmol·L-1DBP与不同浓度ME、MEA、PS(10，50，100 μg·mL-1)共培养18 h。结果见图2。与正常对照组比较，模型对照组斑马鱼眼部细胞凋亡数目显著增加(P<0.01)。与模型对照组比较，1 μmol·L-1人参皂苷Rg1组斑马鱼眼部细胞凋亡数目显著降低(P<0.01)；10 μg·mL-1MEA和PS组斑马鱼眼部细胞凋亡数目显著降低(P<0.01)；100 μg·mL-1ME及中、高浓度MEA、PS组斑马鱼眼部细胞凋亡数目均显著降低(P<0.01)。提示3种归芍方提取物均能拮抗斑马鱼眼部细胞凋亡，且与ME组比较，PS和MEA组抗眼部细胞凋亡作用更为显著。

①与48 h对照组比较，t=10.960～42.750，P<0.01；②与104 μg·mL-1ME(24 h)组比较，t=17.330，P<0.01；③与24 h 对照组比较，t=13.860，17.320，P<0.01；④与104 μg·mL-1 MEA(24 h)组比较，t=8.573，P<0.01；⑤与103 μg·mL-1 PS(24 h)组比较，t=8.552，P<0.01；⑥与104 μg·mL-1 PS(24 h)组比较，t=10.960，P<0.01。图1 不同制备工艺归芍方对斑马鱼存活率的影响①Compared with control group at 48 h，t=10.960—42.750，P<0.01；②Compared with 104 μg·mL-1 ME(24 h) group，t=17.330，P<0.01；③Compared with control group at 24 h，t=13.860，17.320，P<0.01；④Compared with 104 μg·mL-1 MEA(24 h) group，t=8.573，P<0.01；⑤Compared with 103 μg·mL-1 PS(24 h) group，t=8.552，P<0.01；⑥Compared with 104 μg·mL-1 PS(24 h) group，t=10.960，P<0.01.Fig.1 Effects of Guishao formula with different preparation processes on the survival rate of

2.3归芍方对斑马鱼胚胎凋亡相关基因Bcl-2蛋白表达的影响 结果见图3。与正常对照组比较，模型对照组Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较，人参皂苷Rg1组Bcl-2蛋白表达水平显著提高(P<0.01)。与模型对照组比较，中、高浓度归芍方显著增加Bcl-2蛋白表达量(P<0.05，P<0.01)。结果表明，归芍方能够有效提高DBP损伤后模型斑马鱼细胞凋亡相关Bcl-2蛋白的表达，从而有效抑制细胞凋亡。

2.4归芍方对斑马鱼胚胎线粒体mtDNA拷贝数的影响 结果见图4，与正常对照组比较，模型对照组线粒体mtDNA拷贝数显著降低(P<0.01)，给予不同浓度归芍方后，线粒体mtDNA拷贝数均呈上升趋势，其中100 μg·mL-1剂量组与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明，归芍方能够有效升高凋亡细胞线粒体mtDNA拷贝数，对线粒体功能具有保护作用。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.人参皂苷Rg1组；D.10 μg·mL-1ME组；E.50 μg·mL-1ME组；F.100 μg·mL-1ME组；G.10 μg·mL-1MEA组；H.50 μg·mL-1MEA组；I.100 μg·mL-1MEA组；J.10 μg·mL-1 PS组；K.50 μg·mL-1 PS组；L.100 μg·mL-1 PS组；①与正常对照组比较，t=12.910，P<0.01；②与模型对照组比较，t=4.418～17.600，P<0.01；③与模型对照组比较，t=3.615，P<0.05。图2 不同制备工艺归芍方对斑马鱼眼部细胞凋亡的影响A.normal control group；B. model control group；C.ginsenosides Rg1 group；D.10 μg·mL-1 ME group；E.50 μg·mL-1 ME group；F.100 μg·mL-1 ME group；G.10 μg·mL-1 MEA group；H.50 μg·mL-1 MEA group；I.100 μg·mL-1 MEA group；J.10 μg·mL-1 PS group；K.50 μg·mL-1 PS group；L.100 μg·mL-1 PS group.①Compared with normal control group，t=12.910，P<0.01；②Compared with model control group，t=4.418—17.600，P<0.01；③Compared with model control group，t=3.615，P<0.05.

A.正常对照组；B.模型对照组；C.人参皂苷Rg1组；D.10 μg·mL-1归芍方组；E.50 μg·mL-1归芍方组；F.100 μg·mL-1归芍方组；①与正常对照组比较，t=8.28，P<0.01；②与模型对照组比较，t=3.98，4.46，P<0.01；③与模型对照组比较，t=3.67，P<0.05。图3 不同制备工艺归芍方对斑马鱼Bcl-2蛋白表达的影响A.normal control group；B.model control group；C.ginsenosides Rg1 group；D.10 μg·mL-1 Guishao formula group；E.50 μg·mL-1 Guishao formula group；F.100 μg·mL-1 Guishao formula group；①Compared with normal control group，t=8.28，P<0.01；②Compared with model control group，t=3.98，4.46，P<0.01；③Compared with model control group，t=3.67，P<0.05.

3 讨论

“肝劳”一词最早见于唐朝孙思邈之《千金要方》，“读书、博弈过度而伤目者，谓肝劳”。视疲劳关键之病机为肝肾两虚，精血不足[9]。肝在体为目，在脏与肝、脾、肾密切相关，故提出“补益肝肾、益气活血、通络明目”的治疗原则，拟定抗视疲劳归芍方。方中当归、白芍为君药，补血活血，养血平肝；川芎活血行气为臣；枸杞益精明目为佐；菟丝子养肝明目为使。整方配伍重在整体调节，补益气血，明目通络，又滋而不腻，补而不滞。本研究对“养血平肝”见长的归芍方缓解视疲劳的药效进行了考察，结果表明归芍方能够有效改善模型斑马鱼眼部细胞凋亡，为归芍方临床应用提供了实验依据。

斑马鱼作为一种便捷高效的体内模型[10-11]，其胚胎发育迅速，易于形态学观察，已逐渐被应用于中药药效学研究[12]。斑马鱼与人类基因高度同源，基因相似度高达87%[13-14]。课题组前期建立DBP诱导斑马鱼眼部细胞凋亡模型[8]，具备高效、稳定等特点。本研究利用该模型对归芍方3种不同提取物及不同浓度对斑马鱼眼部细胞的保护作用进行考察。结果显示ME、MEA和PS在较高浓度下均对斑马鱼眼部细胞具有保护作用；浓度降低后MEA和PS仍具有显著抗凋亡作用。上述研究表明，本方标准化药材饮片配方与药材水提醇沉提取物具有相似活性，药材水提物经醇沉后，效应成分并未丢失，且可能去除一些干扰性成分[15]。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.人参皂苷组；D.10 μg·mL-1归芍方组；E.50 μg·mL-1归芍方组；F.100 μg·mL-1归芍方组；①与正常对照组比较，t=10.98，P<0.01；②与模型对照组比较，t=7.55，P< 0.01图4 归芍方对斑马鱼胚胎线粒体mtDNA拷贝数的影响A.normal control group；B. model control group；C.ginsenosides Rg1 group；D.10 μg·mL-1 Guishao formula group；E.50 μg·mL-1 Guishao formula group；F.100 μg·mL-1 Guishao formula group；①Compared with normal control group，t=10.98，P<0.01；②Compared with model control group，t=7.55，P< 0.01.

视疲劳发病机制与过度用眼，活性氧积累引起氧化应激水平升高造成眼部细胞凋亡相关[16]。本研究发现，归芍方能够显著上调模型斑马鱼抗凋亡蛋白Bcl-2表达量，发挥抗细胞凋亡作用。线粒体功能对维持细胞生命活动发挥重要作用，与细胞凋亡过程密切相关[17]。mtDNA是线粒体内独立的一种双链DNA，是决定线粒体功能的重要因素之一[18]。mtDNA拷贝数的变化能够影响多种疾病的发生发展。本研究表明，归芍方能够有效提高线粒体mtDNA拷贝数，保护线粒体功能，该途径可能与其发挥抗细胞凋亡作用相关。

综上所述，归芍方具有显著的抗模型斑马鱼眼部细胞凋亡的作用。采用DBP诱导斑马鱼眼部细胞凋亡模型，对于中药复方及不同提取物药效评价具有灵敏、高效等特点。本研究为归芍方临床应用提供了实验依据，可为其进一步研究提供参考。