润肠通便合剂对便秘模型小鼠结肠MUC2、AQP3的影响*

王 煜， 王自立， 王志旺， 李喜香， 李济阳

(1. 甘肃省中医院， 兰州 730050; 2. 甘肃中医药大学， 兰州 730000)

便秘(constipation)是一种临床常见的胃肠道疾病，主要表现为粪便干结、排便困难或排便周期长，严重影响人们的生活质量；年老、不良生活习惯以及其他病理、生理因素均可影响排便，并进一步引起便秘，而目前治疗便秘首选药物治疗，如泻药、促胃肠动力药等[1]。中医药在治疗便秘等慢性复杂性疾病方面有明显的优势，结合患者体质、便秘证型以及其他特殊情况，辨证处方，近年来已成为民族医学研究的热点[2]。全国名中医王自立教授从脾虚不运、肠道津亏出发，拟定润肠通便复方并制成合剂，临床应用取得明显的疗效[3]。结肠分泌的粘液润滑肠道而促进排便，结肠黏蛋白(mucin, MUC)表达下调，水通道蛋白(aquaporin, AQP)增加引起水代谢紊乱，使结肠粘液分泌减少，从而形成肠燥便秘之症。本实验复制便秘小鼠模型，研究润肠通便合剂对便秘的治疗作用，同时，从结肠黏蛋白(mucin2, MUC2)、水通道蛋白(aquaporin3, AQP3)及水代谢等方面探讨其润肠通便的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

润肠通便合剂(RunchangTongbianmixture, RTM)，甘肃省中医院制剂中心生产，批号：20200611。常通舒颗粒(ChangtongshuGranule, CTS)，贵州威门药业股份有限公司产品，批准文号：国药准字Z52020172，批号：20200203。复方地芬诺酯片，广西河丰药业有限责任公司产品，批准文号：国药准字H45020028。Muc2试剂盒(ELISA)，南京建成生物工程研究所生产，批号：20200605。

1.2 动物

KM小鼠，雌雄各半，18～22 g，甘肃中医药大学科研实验中心提供并进行实验，实验动物许可证号：SCXK(甘)2015-0002，设施使用许可证号：SYXK(甘)2015-0005。

1.3 仪器

美国伯乐公司生产的CFX型荧光定量PCR仪，日本Olympus公司生产的CH-212型光学显微镜，澳大利亚Dynamica公司生产的VELOCITY18R型冷冻离心机，北京赛多利斯仪器有限公司生产的BS1103型电子分析天平。

1.4 润肠通便合剂对便秘小鼠小肠推进功能及排便的影响

将小鼠按性别体重分层随机分为空白对照组(Control)、模型对照组(Model)、阳性对照组(CTS，7.8 g/kg)以及润肠通便合剂高、中、低剂量组(RTM-H、RTM-M、RTM-L，40、20、10 ml/kg)，每组20只。各组按上述剂量灌胃给药3 d，其中空白对照组、模型对照组灌胃纯净水20 ml/kg。第3日禁食不禁水8 h后灌胃复方地芬诺酯30 mg/kg，其中空白对照组灌胃等量纯净水(10 ml/kg)。30 min后灌胃含相应受试药的墨汁，其中空白对照组、模型对照组灌胃含相同剂量墨汁的纯净水。从上述每组中随机取10只小鼠，灌胃给药25 min后脱颈椎处死，手术取出幽门至盲肠之间的整段小肠，平铺于生理盐水润湿的平面上，轻拉呈直线状态后测量小肠总长度(L)及幽门至墨汁前沿的长度(X)，按(X/L)×100%来计算小肠推进率[4]。各组剩余小鼠分笼饲养，观测小鼠首次黑便时间(首便时间)以及6 h内排便粒数。

1.5 润肠通便合剂对便秘小鼠的影响

小鼠分组同1.4，每组10只。各组小鼠上午8:00灌胃复方地芬诺酯20 mg/kg，其中空白对照组灌胃纯净水10 ml/kg，1次/日，连续14 d[5]；下午2:00各组小鼠按1.4项下剂量灌胃给药，其中空白对照组、模型对照组灌胃纯净水20 ml/kg，连续给药14 d。实验第15日麻醉小鼠后处死，手术取出完整结肠，将靠近小肠的结肠依次取3段：第1段结肠冷冻储存，供测定AQP3基因表达水平；第2段结肠精密称重，干燥至恒重后称重，计算结肠含水量；第3段结肠经HE染色后观测结肠病理学变化。剩余结肠用PBS缓冲液(28℃)灌洗，离心后取结肠灌洗液(colonic lavage fluid, CLAF)上清液，采用ELISA法严格按试剂盒说明书测定Muc2的含量。

1.6 HE染色观测结肠病理学变化

取0.5 cm小鼠结肠用福尔马林固定，经石蜡包埋、切片后行HE染色，镜下观察结肠病理学变化，对结肠组织结构、上皮细胞脱落及炎症细胞浸润程度进行半定量分析：结肠绒毛排列规整、结构清晰记0分，结肠绒毛排列规整、但结构模糊记1分，结肠绒毛排列紊乱、结构模糊记2分；结肠上皮细胞未见脱落记0分，结肠上皮细胞脱落、但未连接成片记1分，结肠上皮细胞脱落并连接成片记2分；可见0～5个炎症细胞浸润记0分，可见6～10个炎症细胞浸润记1分，可见10个以上炎症细胞浸润记2分。

1.7 PCR法测定结肠AQP3 mRNA表达水平

采用Trizol法提取RNA，测定其纯度与浓度。按试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，以cDNA为模板对GAPDH及AQP3 mRNA进行PCR扩增。AQP3上游引物序列为5'-CAAGCTGCCATCTACAC-3’，下游引物序列为5'-AAAGAAGCCATGACCATAT-3'，扩增长度183 bp；GAPDH上游引物序列为5'-AGGTCGGTGTGACGGATTTG-3'，下游引物序列为5'-TGTAGACCATGTAGTGAGGTCA-3'，扩增长度122 bp，由上海生工生物工程股份有限公司提供。检测AQP1及β-Actin的循环数(Ct值)，以β-Actin与模型对照组为对照计算△△Ct，采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量[6]。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 润肠通便合剂对便秘小鼠排便的影响

与空白对照组相比，模型对照组小鼠首便时间明显延长，6 h排便粒数明显减少(P<0.01，表1)；与模型对照组相比，在润肠通便合剂的干预下，首便时间明显缩短，6 h排便粒数明显增加(P<0.05, 0.01)。

Tab. 1 Effects of RTM on defecation in mice with acute constipation n=10)

2.2 润肠通便合剂对便秘小鼠小肠推进的影响

小鼠按性别、体重分层随机分组后，小肠的总长度没有明显差异。与空白对照组相比，模型对照组小鼠小肠墨汁推进长度以及小肠推进率显著减小(P<0.01，表2)；与模型对照组相比，经润肠通便合剂干预后，小肠墨汁推进长度及小肠推进率明显增加(P<0.05, 0.01)。

Tab. 2 Effects of RTM on small intestinal propulsion of mice with acute constipation n=10)

2.3 润肠通便合剂对便秘小鼠结肠病理学的影响

在光镜下，空白对照组小鼠结肠绒毛排列规整，肠腺丰富，未见炎症细胞浸润，各层组织无明显异常；模型对照组小鼠结肠绒毛排列紊乱、结构模糊，腺体萎缩，部分黏膜上皮脱落，可见炎性渗出。在润肠通便合剂的干预下，结肠上述病理学变化出现不同程度改善。对结肠结构、粘膜脱落及炎性渗出进行半定量分析，结果显示，与空白对照组相比，模型对照组结肠病理学评分显著升高(P<0.01，表3)；与模型对照组相比，润肠通便合剂各剂量组的结肠病理学评分明显下降(P<0.01)。

Fig. 1 Effects of RTM on colonic pathological changes in mice with chronic constipation (HE ×100)

2.4 润肠通便合剂对便秘小鼠近端结肠AQP3基因表达的影响

与空白对照组相比，模型对照组小鼠近端结肠AQP3 mRNA表达明显上调(P<0.01，表3)；与模型对照组相比，润肠通便合剂各剂量组近端结肠AQP3 mRNA表达明显下调(P<0.01)。

Tab. 3 Effects of RTM on colonic pathology and AQP3 mRNA in proximal colon of mice with chronic constipation n=10)

2.5 润肠通便合剂对便秘小鼠结肠含水量及CLAF中Muc2的影响

与空白对照组相比，反复灌胃15 mg/kg复方地芬诺酯后，模型对照组小鼠结肠湿干重比值以及CLAF中Muc2明显下降(P<0.01，表4)；与模型对照组相比，在润肠通便合剂的干预下，结肠湿干重比值以及Muc2明显回升(P<0.05, 0.01)。

Tab. 4 Effects of RTM on Fecal water content and Muc2 in CLAF of mice with chronic constipation n=10)

3 讨论

便秘(constipation)是一种常见的胃肠道疾病，中医药在治疗便秘等慢性复杂性疾病方面有明显的优势，结合患者体质、便秘证型以及其他特殊情况，辨证处方，近年来已成为民族医学研究的热点[7,8]。全国名中医王自立教授在多年临床的基础上，从脾虚不运、肠道津亏立论拟定润肠通便复方(现已制成合剂)。润肠通便合剂由肉苁蓉、枳壳、郁李仁等中药组成，方中肉苁蓉益肾助阳、润肠通便，枳壳善能理气宽中、行滞消胀，郁李仁功擅润燥滑肠，诸药合用，攻补兼施，寓攻于守，使补无滞气碍脾、攻无耗气伤津之弊，共奏健脾助运、润肠通便之效，临床应用取得明显的疗效[9]。本次实验采用复方地芬诺酯复制便秘小鼠模型，研究结果显示，润肠通便合剂可加速小肠蠕动而增加小肠内容物的推进长度，提高推进率；缩短首次排便时间，增加6 h内排便粒数。润肠通便合剂可改善便秘结肠的病理学变化，使结肠绒毛排列趋于规整，抑制结肠上皮细胞脱落，缓解炎症细胞浸润。

结肠动力减弱、内容物传输功能减慢，肠道内容物长时间滞留在结肠，内容物中细菌、毒素等进入肠腔上皮组织，改变肠道黏膜内环境，肠道上皮中杯状细胞等分泌细胞分化、转化的速度减慢，黏蛋白(MUC)合成、分泌不足，保护肠黏膜、润滑粪便的功能降低。目前发现肠道有20余种黏蛋白，其中MUC2是肠道重要的分泌型黏蛋白，MUC2水化后形成水凝胶黏液屏障来保护肠道上皮组织，同时覆盖于粪便表面而发挥润肠通便的作用[10]。另一方面，随着结肠肠道、肠粘膜及肠壁生理环境的改变，刺激肠道上皮水通道蛋白(如AQPs)的表达与迁移，尤其是随着近端结肠AQP3表达的增加，结肠对水分的吸收速度加快，这也是远端结肠中粪便含水量下降、粪便干燥的主要原因之一[11,12]。本次研究通过受试药干预便秘动物模型，结果发现润肠通便合剂能抑制结肠AQP3的表达，改善结肠水代谢而提高组织的水含量，同时润肠通便合剂可促进结肠黏膜分泌MUC2，保护肠黏膜、润滑粪便而利于排出。