依达拉奉对毒死蜱所致大鼠脑损伤的保护作用及其机制*

林佩瑶， 宋 英， 秦东旭， 卢栋泽， 范徐丽

(浙江工业大学药学院， 杭州 310014)

动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1, DRP1)在线粒体破裂的过程中起主导作用，表现为DRP1在线粒体受损时聚集于外膜，最终细胞凋亡[7]。依达拉奉(edaravone , ED)是临床上常用的自由基清除剂，其对脑神经的保护作用已得到证实[8]，但ED如何通过DRP1改善毒死蜱导致的细胞凋亡仍少见报道。本实验通过皮下注射毒死蜱建立脑损伤模型，用依达拉奉进行治疗，探讨依达拉奉缓解毒死蜱蓄积导致的神经细胞损伤与DRP1蛋白的相关性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

毒死蜱 (Chlorpyrifos, 上海阿拉丁), 依达拉奉 (Edaravone, Mitsubishi Chemical Corporation, Janpanse), RIPA裂解液，ATP检测试剂盒 (ATP Assay Kit, 碧云天), ATP酶试剂盒(Adenosinetriphosphatase Assay Kit, 南京建成), GAPDH抗体、DRP1抗体(Abcam, USA)、phospho-DRP1(Ser637) 抗体 (Affinity Biosciences, China), 酶标仪 (型号: speetramaxMZe, MoleeularDevices , USA), 透射电子显微镜 (型号: H7650, HITACHI, Janpanse) 等。

1.2 实验动物饲养

体重在220～250 g之间的成年健康雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，清洁级，浙江省医学科学院实验动物中心(SCXK-2019-0002)。所有动物在RT 25℃，湿度50%，保持12 h光明和黑暗交替的环境下饲养1周。本研究经浙江工业大学实验动物伦理委员会审查批准。

1.3 毒死蜱脑损伤模型的建立

通过随机分组，将大鼠分为对照组(Control), 毒死蜱组(Model)，依达拉奉组(ED)。橄榄油溶解毒死蜱后，连续28 d以18 mg/kg的剂量将其皮下注射于大鼠颈部[9,10]。在28 d内，依达拉奉组在注射毒死蜱1 h后，通过腹腔注射纯度为99%的依达拉奉(10 mg/kg)[11]予以治疗。

1.4 行为学检测

1.4.1 旷场试验 实验进行28 d后，在黑色不透明钢板制成的干净无味箱子 (大小为45 cm×45 cm×50 cm) 中进行试验。每次将大鼠沿箱壁放入，并允许自由探索3 min，整个实验过程的动物行为记录在ANY-maze分析系统中。

1.4.2 Morris水迷宫 旷场实验结束后，将大鼠置于直径1.2 m，高0.5 m的圆形黑色水池中，水温保持在23℃左右。设置四个象限，每个象限各有一个参照物。水上逃生平台直径0.14 m，高0.3 m，低于液面1 cm左右，置于第Ⅱ象限。摄像头置于水池上方，实时录像。每次从四个象限内背对实验者抛入，训练其2 min内找到逃生平台，训练4 d后，通过ANY-maze系统分析评判大鼠的学习记忆能力。

1.5 HE染色

用生理盐水和4%多聚甲醛进行心脏灌注，取脑组织浸入石蜡，4 μm切片。HE染色光镜下观察病理损伤。

1.6 透射电镜观察神经元细胞

同上，取脑组织用2.5%(0.025 g/ml)戊二醛固定，4℃过夜，次日按标准程序包埋并超薄切片，在透射电镜下观察细胞凋亡和线粒体形态。

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1.7 线粒体损伤相关生化指标检测

每20 mg大鼠脑组织样品加入100～200 μl裂解液进行裂解匀浆，把匀浆组织液转移至离心机后，4℃、12,000 g 离心 5 min，取上清液。根据试剂盒说明书步骤得到ATP含量和Na+-K+-ATP酶活力。用BCA试剂盒检测蛋白质浓度。

1.8 Western blot检测

提取部分大鼠脑组织蛋白，变性后，电泳分离，转膜封闭，4℃下孵育兔抗DRP1多克隆抗体(1∶ 1 000)、兔抗phospho-DRP1(Ser637) 多克隆抗体(1∶1 000)，过夜。次日，室温下孵育山羊抗兔二抗(1∶5 000)2 h，显影。

1.9 免疫组织化学

将大鼠脑组织石蜡切片水化，柠檬酸抗原修复，BSA封闭，滴加一抗和二抗。DAB显色，HE再染后，光镜观察。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 依达拉奉对毒死蜱损伤大鼠的学习记忆能力的影响

如图1和表1所示，旷场试验中，与Control组比，Model组运动轨迹较短，在旷场中运动总距离缩短(P<0.01)，平均速度下降(P<0.01)。而经依达拉奉给药后，ED组大鼠活动更频繁，运动距离与平均速度有显著改善 (P<0.05)。

Fig. 1 Edaravone improves the ability of learning and memory in rats

Tab. 1 The total movement distance and average speed of the rats in each group in the open field test n=6)

如图2和表2所示，水迷宫试验中，与Control组比较，Model组活动轨迹较复杂且逃避潜伏期增长(P<0.01)，1 min内穿越平台次数明显减少(P<0.01)。经依达拉奉治疗后，大鼠活动轨迹简单，逃避潜伏期明显缩短(P<0.01)，穿越平台次数显著增加(P<0.01)。

Fig. 2 Edaravone improves the ability of learning and memory in rats

Tab. 2 The crossing-target number and the escape latency of rats in each group crossed the platform in the water maze n=6)

2.2 依达拉奉对毒死蜱诱导的大鼠脑组织病理损伤的影响

如图3所示，Control组海马CA1、CA3、DG区神经元分布整齐、密集，神经元细胞核和细胞质清晰可见，胞浆浅染。与对照组相比，毒死蜱损伤组海马区域的正常细胞含量减少，且分布不规则，主要表现为细胞边界不清、胞浆减少或消失，可见CA3区损伤。依达拉奉给药后，与Model组相比，ED组大鼠CA3区神经细胞损伤程度明显减轻，神经细胞分布较为整齐，胞浆浅染增多。

Fig. 3 Edaravone protected against Chlopyrifos induced hippocampal injury in SD rats (n=3)

2.3 依达拉奉对毒死蜱诱导大鼠脑细胞损伤的影响

如图4所示，Control组细胞核核膜正常，线粒体内嵴完整。Model组核膜破裂，染色质断裂凝集，核固缩；且线粒体内嵴断裂。经ED给药后，大鼠脑组织中细胞核膜相对完整，正常线粒体的数量增加，线粒体膜破裂与嵴断裂的现象也明显减少。

Fig. 4 Determination of mitochondrial and cell nucleus damage levels (n=3)

2.4 依达拉奉对毒死蜱诱导脑损伤大鼠的Na+-K+-ATP酶活性与ATP含量的影响

通过检测细胞内Na+-K+-ATP酶活性和ATP含量来评价线粒体供能状况。如表3所示，与Control相比，反复暴露于毒死蜱的大鼠脑组织中Na+-K+-ATP酶活性与ATP含量明显降低(P<0.01，P< 0.05)。而经ED给药治疗后，钠钾ATP酶活性恢复(P<0.01)，三磷酸腺苷含量也明显升高(P< 0.05)。提示ED对于CPF导致的线粒体功能障碍具有显著的治疗作用。

Tab. 3 Determination of mitochondrial damage levels (%， n=6)

2.5 依达拉奉对毒死蜱诱导脑损伤大鼠DRP1- Ser637位点的磷酸化表达及线粒体损伤的影响

采用免疫组化探究各组DRP1蛋白及其Ser637位点的磷酸化表达，结果如图5和表4所示：线粒体分裂蛋白DRP1在各组大鼠脑组织中均有棕色显色。DRP1的Ser637位点的磷酸化蛋白棕色显色在Model组中明显减少 (P<0.05)，但这种趋势在经ED给药后得到显著性逆转(P<0.05)。

Fig. 5 The effects of ED on the expressions of DRP1 and p-DRP1-Ser637

Tab. 4 Mean optic density of DRP1 and p-DRP1 -Ser637 and the ratio of relative levels of p-DRP1-Ser637 and DRP1 of rat among different groups n=3)

采用免疫印迹法探究各组DRP1蛋白及其Ser637位点的磷酸化表达，结果如图6和表4所示，以DRP1蛋白表达量为参照，p-DRP1-Ser637在Model组表达显著减少(P<0.01)，依达拉奉组表达明显增多(P<0.01)。

Fig. 6 The expressions and ratio of p-DRP1-Ser637 and DRP1 in each group

3 讨论

在我国，毒死蜱作为广谱杀虫剂，被广泛用在各种作物的种植。但长期地暴露在低浓度的毒死蜱中，对人类的健康产生了影响。研究表明，毒死蜱作用孕鼠或新生小鼠会引发中枢神经发育障碍，同时影响神经轴突运输和神经元功能[10]。除此之外，长期暴露于毒死蜱将增加患帕金森和阿尔兹海默症的风险[12]。我们之前的体外研究表明，200 μmol/L下的毒死蜱会诱导PC12细胞的凋亡[13]；徐等人发现，15 mg/kg 的毒死蜱会改变大鼠脑组织线粒体的超微结构，降低线粒体电位，干扰细胞抗氧化能力，导致细胞凋亡[14]。本研究中发现长期皮下注射毒死蜱，SD大鼠的学习记忆、运动能力明显下降。正常生理情况下，海马CA3区是控制大脑学习、记忆及运动的重要区域。动物脑组织苏木素染色显示毒死蜱组海马CA3区被破环，神经元数量显著减少。这提示长期暴露于毒死蜱会导致大脑神经细胞的损伤。

线粒体是生成ATP的主要场所，能量产生需要氧化磷酸化，而线粒体发生氧化磷酸化是依靠正常的形态和生物活性。在本研究中，我们在电镜下观察到毒死蜱组线粒体损伤，伴随着ATP含量和Na+-K+-ATP酶活性下降。

DRP1是一种胞浆动力蛋白样GTP酶[15]，是调控线粒体裂变的主要蛋白，同时也介导线粒体依赖性细胞凋亡：在氧化应激刺激下，它被募集到线粒体上，引起线粒体肿胀和外膜上通透性转换孔的大量开放，继而提高线粒体膜通透性并引起细胞色素酶C的大量释放。Cyt C作用于凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)、催化天冬氨酸蛋白水解酶-9，激活天冬氨酸蛋白水解酶-3，最终细胞凋亡[16]。但DRP1的活性受蛋白翻译后修饰的调节，其Ser637位点被磷酸化后，可抑制DRP1向线粒体膜的转运，减少线粒体碎片化从而保护细胞[17]。我们通过电镜观察到毒死蜱组细胞核和线粒体形态明显改变；进一步用免疫组化及免疫印迹反映DRP1的Ser637位点磷酸化表达情况，发现毒死蜱抑制了DRP1的Ser637位点磷酸化表达，从而促进线粒体损伤和细胞凋亡。

依达拉奉是临床中常用的脑保护药物。在此前的研究中，我们发现依达拉奉能通过抑制5-脂氧合酶 (5-LOX)的激活来维持线粒体的超微结构，保护神经元免受缺血损伤[18]；同时依达拉奉能通过NRF2减轻毒死蜱对PC12细胞的氧化应激损伤[19]。此外，依达拉奉的预防给药具有抗炎作用，抑制肺中毒小鼠的细胞凋亡[20]。但是依达拉奉通过DRP1分子保护线粒体，减少细胞凋亡的研究较少。我们这次实验侧重探究毒死蜱损伤下，依达拉奉与线粒体DRP1蛋白的关系。结果发现，依达拉奉使线粒体碎片化减少、细胞核形态恢复正常；也促进了DRP1蛋白的Ser637位点磷酸化表达。因此，依达拉奉通过抑制线粒体分裂，保护神经元细胞的作用得以证实。

综上，本文的研究发现，依达拉奉通过促进DRP1的Ser637位点磷酸化的表达减轻毒死蜱所致大鼠脑损伤。这为治疗毒死蜱所致中枢神经病变提供新的实验思路，同时我们也希望进行更深入研究来探讨依达拉奉促进p-DRP1-Ser637表达的潜在途径。