Synaptotagmin 1基因敲除对小鼠行为的影响*

武南南， 封芮芮， 张 宇， 李 光， 曹济民， 殷丽天△

(1. 山西医科大学生理学系， 细胞生理学教育部重点实验室， 细胞生理学山西省重点实验室， 太原 030001； 2. 西南医科大学心血管医学研究所， 医学电生理学教育部重点实验室， 四川 泸州 646000)

焦虑障碍在世界范围内的患病率逐年升高，其相关临床和基础研究也受到广泛关注[1]。焦虑的特征是持续的觉醒、警惕和恐惧，由多个脑区介导，如杏仁核、终纹床核、前额叶皮层和海马等[2]，其中杏仁核被认为是调节焦虑的关键脑区。同时，大量证据支持多个神经递质系统参与焦虑发生-焦虑缓解过程[3]，以往对于焦虑及情感障碍发病机制的研究主要集中在5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)等递质通路。尽管目前对焦虑障碍的研究已受到重视，但苯二氮卓类、5-HT抑制剂等仍是目前主要的治疗方式，存在治疗效果差或复发等问题。所以，有必要深入地阐明焦虑及情感障碍发病机制，从分子角度寻找安全有效的药物和治疗方法[4]。

突触结合蛋白1(Synaptotagmin 1，Syt1)是synaptotagmin蛋白家族的成员，在前脑、中脑以及大多数脑干和脊髓神经元中表达[5]。Syt1在突触胞吐和其他类型的Ca2+诱导的分泌过程中充当Ca2+感受器[5]，使神经递质的释放与动作电位(APs)同步，既是钙离子快速释放的感受器，又是自发和延迟异步释放的抑制剂[6]。研究发现，在许多突触中Syt1的基因缺失可以取消快速同步释放成分，并且导致自发和异步释放的几倍增强[6]。Syt1、Synaptophysin和SNAP-25等突触相关蛋白的表达水平与学习和记忆呈正相关，但与焦虑和运动活动呈负相关[7]。在人类和啮齿动物的相关研究显示，杏仁核是焦虑环路中的一个关键节点。临床研究发现杏仁核的体积与焦虑水平正相关[8]，并且社交焦虑症患者杏仁核的激活会增加[9]。此外，焦虑性刺激后Fos蛋白免疫组织化学检测发现将啮齿动物暴露于产生焦虑的环境中杏仁核被激活[10]，并且使用药物失活杏仁核有抗焦虑作用[11]。谷氨酸(glutamate，Glu)是人脑内最主要的兴奋性神经递质，由突触前膜释放，经突触间隙与突触后膜上的受体结合产生活化作用。Glu在大脑中的分布很广泛，约85%的突触是Glu能的[12]。杏仁核Glu含量升高可以导致神经元兴奋性增强，进而引起焦虑水平的增加。在动物实验中，通过阻断NMDA受体能够有效降低应激引起的焦虑程度。并且，应激所导致的Glu能神经系统功能增强可引起细胞内钙离子浓度升高和神经毒性，进而影响相关脑区的正常功能，这也可能与某些焦虑障碍的发病有关[13]。

基因敲除(gene knockout)是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，达到阻止基因表达的作用。本研究拟采用Syt1基因敲除的杂合子(Syt1+/-)和野生型小鼠为实验对象，通过旷场、高架十字迷宫和强迫游泳实验来初步探究Syt1+/-小鼠的焦虑样行为改变，分析Syt1在多个焦虑相关脑区的表达情况，并研究其杏仁核区谷氨酸的含量变化，旨在为Syt1导致焦虑样行为及其发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

旷场实验设备、高架十字迷宫实验设备、强迫游泳设备和视频采集与存储系统购自成都泰盟软件有限公司；冰冻切片机购自德国Leica公司；超高效液相色谱仪购自美国Thermo Scientific公司；质谱仪购自美国AB SciexTM公司。Syt1抗体购自中国Proteintech公司；Alexa Fluor 594标记的驴抗兔抗体购自美国Invitrogen公司。

1.2 实验动物

以基因型Synaptotagmin 1敲除(Syt1+/-)及同窝野生型(wild type，WT)雄性小鼠为研究对象。Syt1+/-小鼠由本实验室曹济民课题组提供，该鼠种原由赛业(广州)生物科技有限公司协助建立。新生小鼠PCR基因型鉴定后使用。所有动物饲养于SPF级动物房。温度为(22±1)℃，保持12 h的照明/黑暗昼夜节律，自由进食和饮水。

行为学实验采用8周龄小鼠，分为2组：WT组(n=10)和Syt1+/-组(n=9)。免疫荧光实验由8周龄WT小鼠和Syt1+/-小鼠各5只，取前额叶皮层、海马、杏仁核、伏隔核、纹状体和腹侧被盖区等脑组织检测Syt1蛋白的表达情况。神经递质检测选取8周龄WT小鼠和Syt1+/-小鼠各5只取前额叶皮层、海马和杏仁核组织检测谷氨酸含量。所有实验动物的饲养和使用严格遵守相关条例。实验过程严格按照山西省动物伦理协会指导原则操作。

1.3 旷场实验

将小鼠放置在一个正方体黑色塑料箱(50 cm×50 cm)中，使其自由探索5 min。使用行为学实验系统记录并进行分析小鼠总运动距离、中心区停留的时间和运动距离、中心区停留时间所占比例和外周区域运动时间。每只小鼠测试完成后清理设备，待完全干燥后进行下一只实验。

1.4 高架十字迷宫实验

实验时将小鼠放在中央正方形区同一位置，面朝闭合臂，允许其自由探索迷宫5 min。采用行为学实验系统分析记录测试过程中的运动活动(开臂与闭臂中移动的距离)，以及进入开臂与闭臂的次数和在其中停留的时间。每只小鼠测试完成后清理设备，待完全干燥后进行下一只实验。

1.5 强迫游泳实验

被试小鼠放置在一个玻璃透明圆柱体(直径10 cm，高35 cm)中，装水(25 cm，25℃)5 min，软件视频记录不动时间(immobility)。结束后将小鼠放回到干净的笼子里，擦干并烘干小鼠毛发。换水清理，再进行下一只实验。

1.6 免疫荧光染色

采用8周龄WT和Syt1+/-雄性小鼠各5只，取前额叶皮层、海马、杏仁核、伏隔核、纹状体和腹侧被盖区进行免疫荧光实验。小鼠麻醉后经心内灌注0.9%生理盐水，然后灌注4%多聚甲醛，取脑。用冰冻切片机切成30 μm厚度的切片。选取脑片，冰PBS洗涤3次，用0.3% Triton X-100在37℃渗透10 min，然后与10%驴血清在37℃孵育30 min，使用Syt1抗体(1∶200)孵育过夜。PBS洗涤3次后，Alexa Fluor 594二抗(1∶1 000)在37℃孵育90 min。显微照片是用荧光显微镜分析获得(每组5只，每只动物取3幅图像)。使用Image J软件计数，Graphpad Prism 8软件统计分析。

1.7 神经递质检测

8周龄WT和Syt1+/-小鼠各5只，用于神经递质检测。小鼠颈椎脱臼处死后，迅速取出脑组织，冰上快速分离前额叶皮层、海马和杏仁核，用冰PBS冲洗随后保存于-80℃冰箱待检测。采用液相色谱串联质谱(LC-MS)方法检测小鼠前额叶皮层、海马及杏仁核的Glu含量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 免疫荧光染色

荧光显微镜下，在前额叶皮层，海马，杏仁核，伏隔核，纹状体和腹侧被盖区神经元细胞质内可见红色荧光免疫反应阳性产物为Syt1蛋白。与WT组相比，各脑区Syt1+/-组Syt1阳性细胞数存在不同程度的显著减少(图1)。统计结果显示，与WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠前额叶皮层(P<0.01)、海马(P< 0.01)、杏仁核(P<0.01)，伏隔核(P<0.01)，纹状体(P<0.01)和腹侧被盖区(P<0.01)Syt1阳性细胞数显著减少(表1)。

Fig. 1 The expressions of Syt1 in prelimbic cortex (PL), hippocampus (HIP), amygdala (AMY), accumbens nucleus (ACB), caudoputamen (CP) and ventral tegmental area (VTA) detected by immunofluorescence assay in WT mice (n=5) and Syt1+/- mice (n=5， Bars=20 μm, immunofluorescence ×40)

Tab. 1 Syt1 positive cells in different brain regions of WT and Syt1+/- mice n=5)

2.2 旷场实验

在旷场实验(open field, OF)中，与WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠在暴露于新环境时表现出更少的总运动距离(P<0.01，表2)。Syt1+/-小鼠在新环境中心停留的时间、中心区运动距离均明显低于WT小鼠(P<0.01)，并且在中心区停留时间的百分比也明显降低(P<0.01)。然而在旷场周边，Syt1+/-小鼠比WT小鼠停留的时间更长(P<0.01)。这些数据表明，缺乏Syt1的小鼠具有高焦虑的特征。

Tab. 2 Open field test of WT mice and Syt1+/- mice

2.3 高架十字迷宫实验

高架十字迷宫实验(elevated plus maze，EPM)中，与WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠的“开臂进入次数”较WT小鼠显著降低(P<0.05)，进入中心区的次数也显著降低(P<0.05，图2A)；开臂移动距离显著降低(P<0.01，图2B)；“开臂滞留时间”较WT小鼠显著降低(P<0.01)，而“闭臂滞留时间”较WT小鼠显著升高(P<0.01，图2C)。图2D，E显示WT和Syt1+/-小鼠在实验中的运动轨迹。总而言之，EPM测试表明Syt1+/-小鼠的焦虑水平有所升高。

Fig. 2 Syt1+/- mice showed decreased open arm entries and spent less time in open arm of EPM

2.4 强迫游泳实验

强迫游泳实验(forced swim test，FST)中，WT小鼠的不动时间为(269.0±4.3)s，Syt1+/-小鼠的不动时间为(291.3±1.6)s。结果显示，与WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠的不动时间显著增加(P<0.01)。

2.5 神经递质检测

结果显示，与WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠前额叶皮层和海马中Glu的含量无统计学差异。而Syt1+/-小鼠杏仁核Glu的含量较WT小鼠显著增加(P< 0.01，表3)。

Tab. 3 The concentrations of glutamate in the prelimbic cortex (PL)，hippocampus (HIP) and amygdala (AMY) of WT mice and Syt1+/- mice (μg/g, n=5)

3 讨论

在中枢神经系统，已发现Syt1在阿尔茨海默症和癫痫疾病中的潜在功能[14,15]，而在焦虑、抑郁等情感障碍类疾病中未见研究。我们的研究利用多个行为学实验探讨Syt1对小鼠焦虑样行为的影响。旷场实验利用小鼠对新奇环境的探索心理和空旷环境的厌恶恐惧间的平衡来评价小鼠的焦虑状态[16]，可以用于广泛性焦虑测试[17]。Syt1+/-小鼠在旷场实验中表现出在中央区域运动距离与时间的明显降低，总运动距离有所降低，可见其自发活动有所降低，提示缺乏Syt1的小鼠对新鲜环境的好奇程度和自主性降低，探究性活动能力下降，焦虑情绪增强，其趋避性的结果可以提示进一步深入研究焦虑，抑郁相关实验[18]。在EPM实验中，Syt1+/-小鼠表现出进入开臂次数减少，在开臂运动时间与运动距离降低。Syt1+/-小鼠对开臂的厌恶情绪会强于对新环境的好奇，提示小鼠处于焦虑状态[19]。而在强迫游泳实验中，Syt1+/-小鼠较WT小鼠不动时间延长，表明其求生欲望下降，易出现抑郁情绪。以上行为学实验提示，Syt1+/-小鼠的焦虑水平，抑郁程度有所增加。

通过免疫荧光染色观察到，Syt1在前额叶皮层，海马，杏仁核，伏隔核，纹状体和腹侧被盖区均有较高的表达量。与WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠的Syt1阳性细胞数在前额叶皮层，海马，杏仁核，伏隔核，纹状体和腹侧被盖区均有不同程度的降低，平均敲除率为67.2%。表明实验所采用Syt1+/-小鼠可以稳定的降低Syt1蛋白表达，符合本研究的前提和需求。杏仁核作为边缘系统的一部分，是产生情绪，识别情绪和调节情绪，控制学习和记忆的脑部组织。我们的结果显示，被测脑区中杏仁核Syt1表达量较高，而在敲除鼠中其敲除比例也呈较高水平(81.3%)。这从侧面证实，Syt1缺失对于小鼠焦虑行为的影响与杏仁核密切相关。

在中枢神经系统中，Glu是重要的兴奋性神经递质，Glu能系统与焦虑密切相关。而中央杏仁核Glu的增加介导焦虑样行为，杏仁核Glu含量的增加可能与焦虑发生有关，这可能是杏仁核的高度激活促进了焦虑样行为[20]。我们的实验检测了两组小鼠多个脑区Glu的含量，与WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠Glu的含量在杏仁核显著增加，而在前额叶皮层和海马无显著差异。因此推测，杏仁核中Syt1缺失导致神经元自发和异步释放的增加，促进Glu水平的升高，而这可能是小鼠呈现出多种焦虑样行为的潜在原因。

综上所述，Syt1部分缺失小鼠存在较明显的焦虑、抑郁、自主性和探索性下降等行为，其可能机制为杏仁核中Glu自发和异步释放的增加，这对焦虑障碍的发病机制和治疗提供了新的潜在靶点和研究思路。而进一步揭示Syt1在焦虑等情绪调控中的作用及其具体机制，将为相关精神类疾病的治疗提供新途径。