黄连素对PCOS模型大鼠LPS /NF-κB、MAPK信号通路的影响*

赵粉琴， 赵 艳， 刘洁颖， 苟雅姣， 杨永琴

(甘肃中医药大学中西医结合学院， 兰州 730000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)以月经紊乱、不孕、高雄激素，或(和)肥胖[1]，50%～70%胰岛素抵抗(IR)[2]，慢性炎性状态[3]为特征的女性内分泌疾病。早期以生殖紊乱为主，后期则以糖脂代谢紊乱[2]和血栓栓塞以及动脉粥样硬化疾病[4]高发为主。胰岛素抵抗是PCOS 代谢异常程度的重要决定因素[2]，研究其发病机制以寻求长期管理的方法以及中药治疗成为目前研究关注点。

丝裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK) 家族是介导细胞反应的重要信号通路，其中p38-MAPK和c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun nterminal kinase，JNK)是主要两个亚型，可以被炎性因子、游离脂肪酸、高糖和氧化应激等炎症细胞因子激活并参与调节胰腺β细胞的胰岛素分泌，引起的胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和慢性炎性变化[5]，参与调控PCOS的发病[6]。而脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为革兰氏阴性细菌外膜的组成成分，通过激活p38-MAPK和c-Jun 末端激酶(JNK)途径激活核因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)，与慢性低度炎性综合征，如糖尿病、肥胖、PCOS 等疾病的关系密切[7]。

达英-35是治疗PCOS经典药物，雌孕激素联合应用调整月经周期，同时通过抑制PCOS卵泡膜细胞合成雄激素，有降低血清雄激素作用。但在青春期使用存在促进肥胖和胰岛素抵抗，育龄期应用调整月经周期保护子宫内膜作用，但是用药起效慢(3～6个月)，尤其是存在导致血栓高发风险，限制其在临床长期应用。二甲双胍是胰岛素增敏剂，通过改善脂代谢紊乱的作用维持胰岛素的功能和形态[8]，可以纠正PCOS导致的IR有关的某些代谢性紊乱综合征[9]，但对雄激素水平没有改善作用。寻求一种长期管理PCOS的安全用药成为关注的焦点。

研究表明黄连素可有效抑制LPS诱导NF-κB信号通路中关键通路蛋白的表达，并能抑制细胞的MAPK信号通路中p38-MAPK和c-Jun蛋白的表达而用于治疗肠道炎症[10]，也可以改善IR[11-13]。但是对于黄连素单独用于治疗PCOS作用机制研究较少。本研究从核转录因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路入手探索黄连素是否通过影响卵巢组织p38-MAPK/c-Jun/NF-κB信号通路蛋白的表达，达到协调PCOS血清性激素分泌以及改善糖脂代谢异常的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性SPF级SD大鼠6周龄50只(200±20)g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(甘)2015-0005。室温20～25℃，常规饲料喂养，3 d后用于实验研究。

1.2 药品和试剂

来曲唑(每片2.5 mg，江苏恒瑞医药股份有限公司，H19991001)，黄连素(每片0.1 g)，北京中新制药厂，H11020962)，盐酸二甲双胍片(每片0.5 g，中美上海施贵宝制药有限公司，H20023370)，达英-35(炔雌醇环丙孕酮片，每片含2 mg醋酸环丙孕酮和 0.035 mg炔雌醇，拜耳医药保健有限公司，J20140114)，羧甲基纤维素钠(CMC)(国药集团化学试剂有限公司，国药准字H20181203)，血脂和胰岛素试剂盒购自江苏麦莎，总胆固醇(TC，MS3486-B)，甘油三酯(TG，MS3485-B)，胰岛素(INS，MS3462-B)，性激素和炎性因子试剂酶联免疫试剂盒购自江苏菲亚生物科技有限公司(促黄体生成素(LH，MM-0624R1)，促卵泡生成素(FSH，MM-0566R1)，雌二醇(E2，MM-0575R1)，睾酮(T，MM-0624R2)，孕酮(P，MM-0551R1)性激素结合球蛋白(SHBG，MM-0483R2)，脂多糖(LPS，MM-0647R2))；PVDF膜(厂家：Millipore公司，批号：IRVH00010)；ECL发光液(厂家：MILIIPORE，批号：P36599)，Glycine(批号：G8200)、Tris(批号：T8060)、SDS(批号：S8010)，RIPA裂解液(批号：R0010)，Tween-20(批号：20150702)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(批号：P1200)，BCA蛋白定量试剂盒(批号：PC0020)，p38 MAPK抗体 [N1C3-2]、NFkB p65抗体和c-Jun抗体(厂家：GeneTex，批号：GTX110720、GTX107678和 GTX11914)。

1.3 实验分组、造模以及药物干预

随机分出10只为空白组，其余进行造模。动物造模方法：用来曲唑1 mg/(kg·d)，连续灌胃3 周，以阴道脱落细胞显示动物处于动情间期为造模成功；然后随机分成四组，每组10只，分别是模型组、达英组、二甲双胍组和黄连素组。达英-35组给药剂量(0.18 mg/(kg·d)(70 kg人的剂量按照醋酸环丙孕酮2 mg/d))，二甲双胍组给药剂量(0.135 g/(kg·d)(70 kg人的剂量1.5 g/d))；黄连素组给药剂量(0.216 g/(kg·d)(换算成大鼠剂量0.108 g/(kg·d)(70 kg人的剂量1.2 g/d))相当于人的剂量的2倍)结合参考文献[14]，为最佳剂量；每只大鼠灌胃2 ml，空白组和模型组用生理盐水灌胃，连续用药28 d。

1.4 大鼠体重、卵巢指数、子宫指数检测

给药结束后禁食12 h，称重，颈椎脱位处死动物，取子宫、卵巢，精密称得各脏器的质量，一侧卵巢组织，4% 多聚甲醛溶液固定做HE 染色，一侧卵巢用液氮冻存。并计算单侧卵巢指数(单侧卵巢重量mg/大鼠体重g)，子宫指数(子宫重量mg/大鼠体重g)。

1.5 经苏木精-伊红(HE) 染色于光镜下观察卵巢组织病理变化

取多聚甲醛溶液固定的卵巢组织，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后， 以4 μm厚连续切片，HE染色(BDH，普尔，英国)。光镜下观察卵巢变化，每个卵巢以5张切片为宜，计算所有切片卵泡数量和级别。

1.6 大鼠血清性激素、糖脂代谢水平的检测

给药结束后禁食12 h，尾尖取血采用(欣舒测AB-103G血糖仪，批号：CZ119799)(葡萄糖脱氢酶法)测空腹血糖(fasting plasma glucose，FBG)值。在处死前心脏取血1.5 ml，在4℃以3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清移入EP管，置于-20℃冰箱保存，做其他血清学指标检测。采用酶法测空腹胰岛素(insulin)、甘油三酯(triglyceride，TG)和胆固醇(cholesterol，TC)；采用ELISA法检测血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、雌激素(estrogen，E2)、睾酮(testosterone，T)和孕酮(progesterone，P)；性激素结合蛋白(sex hormone binding protein，SHBG)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，按试剂盒操作步骤进行，96孔检测，设置空白孔(不加样)，标准孔(加样50 μl)，待测孔(先加样品稀释液40 μl，再加待测样10 μl)，显色，在15 min内使用酶标仪在450 nm波长进行吸光度 (OD) 检测。计算稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostatic model assessment for insulin resistance, HOMA-IR)。HOMA-IR 公式为：HOMA-IR =空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mIU/L)/ 22.5。

1.7 蛋白免疫印迹(Western blot)检测卵巢组织p38-MAPK、NF-κB和c-Jun蛋白表达

取冻存卵巢组织200 mg，按照试剂盒说明进行，加入一抗(p38-MAPK和NF-κB为1∶1 000 稀释，c-Jun为1∶250 稀释)，以β-actin(1∶5 000)抗体为内参，4℃孵育过夜。洗膜后加二抗，山羊抗兔(1∶5 000稀释) 孵育2 h，免疫荧光增强法显色，采用Image J对条带进行灰度值分析量化。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠体重、卵巢指数、子宫指数比较

与空白组比较，模型组大鼠体重明显增加(P<0.05，表1)，子宫指数降低(P<0.05)，卵巢指数无影响；与模型组比较，二甲双胍组、达英-35组、黄连素组能增加子宫指数(P<0.05)，对卵巢指数无影响。

Tab. 1 The body weight, ovarian index and uterine index in each group n=10)

2.2 大鼠卵巢组织病理学

空白组卵巢内有不同发育阶段的卵泡及多个黄体，成熟卵泡颗粒细胞多为6～8 层，形态完整，排列整齐，卵泡膜细胞呈梭形排列。模型组卵泡囊性扩张，多个初级卵泡，窦卵泡颗粒细胞层变薄，个别呈空泡样变性。与模型组比较，黄连素增加初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量(P<0.05，图1，表2)，与达英-35类似，尤其可以降低闭锁卵泡数量(P< 0.05)和囊状卵泡数量(P<0.01)，而二甲双胍在增加成熟卵泡和降低囊状卵泡方面有差异(P<0.05)。

Tab. 2 The number of follicles of different grades in each group n=10)

Fig. 1 Histopathologicalprofiles of ovary tissues(HE ×400) multiple follicles (black arrows), vacuolated degeneration (red arrow), sinus follicles, absence of oocyte nuclei (white arrows);A,A1: Control group; B,B1: Model group; C,C1: Dyne-35 group; D,D1: Metformin group; E,E1： Berberine group

2.3 大鼠血清性激素水平变化

与空白组比较，模型组大鼠血清LH、T水平和LH/FSH比值升高(P<0.05，表3)，FSH水平下降(P<0.05)，E2和P水平无差异，符合PCOS血清学标志；与模型组比较，黄连素降低大鼠血清 LH、T水平以及LH/FSH比值(P<0.05)，作用与达英-35、二甲双胍类似，尤其在降血清T水平作用更显著(P<0.01)，对血清E2和P影响差异无统计学意义。

Tab. 3 The levels of FSH, LH, E2, T and P in rats n=10)

*P<0.05vsnormal group；#P<0.05vsmodel group

2.4 大鼠血清糖脂代谢变化

与空白组比较，模型组大鼠总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、胰岛素含量和胰岛素指数(HOMA)增加(P<0.05，表4)，空腹血糖(FBG)变化没有差异(P>0.05)；与模型组比较，黄连素组能降低甘油三酯(TG)、空腹胰岛素水平和胰岛素指数(P<0.05)，作用类似二甲双胍组，而达英-35对PCOS大鼠糖脂代谢没有影响(P>0.05)。

Tab. 4 The levels of TG， TC， FBG， Insulin and HOMA in rats n=10)

2.5 大鼠血清性激素结合蛋白和脂联素含量分析

与空白组比较，模型组大鼠血清SHBG减少，LPS含量增加(P<0.05，表5)；与模型组比较，黄连素能增加血清SHBG和降低LPS含量(P<0.05)，作用与二甲双胍类似，而达英-35可以增加血清SHBG含量(P<0.05)。

Tab. 5 The levels of SHBG and LPS in rats n=10)

2.6 大鼠卵巢组织炎性蛋白表达分析

与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织内p38-MAPK、NF-κB和c-Jun蛋白表达增加(P<0.05，图2，表6)；与模型组比较，黄连素能明显下调大鼠卵巢内p38-MAPK和NF-κB蛋白表达(P<0.05)，对c-Jun蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，作用与达英-35类似，而二甲双胍对卵巢内38-MAPK、NF-κB和c-Jun蛋白表达差异无统计学意义(P> 0.05)。

Tab. 6 The expression levels of p38-MAPK, c-Jun and n=10)

Fig. 2 Protein expressions in rat ovary tissues

3 讨论

多囊卵巢综合征(PCOS)的月经紊乱和不孕严重影响女性的生殖和健康。肥胖、性激素代谢和糖脂代谢紊乱以及胰岛素抵抗(IR)是 PCOS 发生发展的重要危险因素。PCOS患者胰岛素抵抗，与高水平黄体生成素(LH)和雄激素(T)水平增加互为因果，已经成为PCOS诊断不可或缺的临床和血清学指标[2]。改善导致PCOS 代谢异常程度的重要决定因素-胰岛素抵抗(IR)，是治疗PCOS的重要方法之一。现在研究表明PCOS 的病理机制不再单纯地局限于下丘脑-垂体-卵巢轴功能失调，可能与肠道菌群紊乱[15]产生的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活 TLR4/NF-κB 信号通路，启动炎症因子活动导致肥胖和胰岛素抵抗(IR)发生[16,7]。所以研究PCOS导致IR发病机制以及对其干预作用就显得尤为重要。

血液中雄激素浓度较高和/或临床表现高雄激素状态是多囊卵巢综合征(PCOS)发病的关键[2]，雄激素(T)分泌量过多，抑制卵泡发育成熟以及合成雌二醇障碍，反馈性刺激垂体分泌LH量增加，进一步抑制卵泡发育成熟，卵巢呈多囊样改变。研究表明黄连素降低PCOS大鼠血清 LH、T水平以及LH/FSH比值，增加卵巢内初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量，作用与达英-35类似，尤其可以降低闭锁卵泡数量和囊状卵泡数量，这与黄连素抑制PCOS卵巢组织p38和JNK蛋白表达，p38/JNK显著降低卵巢内细胞色素P450 17α-羟化酶(CYP17)m RNA 的表达，促进卵巢颗粒细胞的自噬，抑制卵泡膜细胞合成雄激素的能力，改善 PCOS高雄激素状态有关[17]。同时也与黄连素减低LPS水平，抑制NF-κB活性，减轻卵巢组织炎性状态，促进多囊卵巢患者颗粒细胞类固醇的生成[18]有关。此结果与Xie研究[19]黄连素在降低PCOS患者总睾酮和黄体生成素方面优于卵泡刺激素一致。同时黄连素也能明显减低PCOS大鼠体重，减少总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量，与黄连素通过肝细胞发挥消耗葡萄糖，促进脂肪转化，类似二甲双胍，属于胰岛素增敏剂范畴[20,21]。同时达英-35、二甲双胍和黄连素都有升高血清SHBG，这与他们降低血清睾酮、减轻体重和减轻胰岛素抵抗，促进雌激素分泌，促进肝脏合成性激素结合蛋白能力有关[2]。

综合以上研究，黄连素除了与二甲双胍都可以改善PCOS大鼠糖脂代谢异常和减轻体重，同时也可以降低PCOS大鼠高雄激素和高黄体生成素水平，作用类似达英-35，其作用机制可能是改善PCOS慢性炎性状态，抑制卵巢内p38-MAPK、c-Jun和NF-κB蛋白表达促进颗粒细胞自噬而实现，这可能是黄连素用于长期对PCOS管理的作用机制的一个方面，更多作用机制希望在以后研究中进行探讨。