外泌体对前列腺癌诊断的研究进展

李哲源，王志刚，王红梅，闵卫平

(1.南昌大学基础医学院a.病理生理教研室； b.免疫学教研室； 2.江西省医学科学院肿瘤研究所,南昌 330006)

在我国，由于医疗资源的不足和个人对身体健康的忽视，很多患者发现肿瘤时已处于晚期，错失了最佳治疗时机，其治疗效果和预后较差[1]；而对外泌体的检测能够反映肿瘤的发生与发展，为诊断提供更多信息，为癌症的早期发现提供一条新途径。肿瘤循环细胞(CTC)检测主要用于去势抵抗性前列腺癌患者(CRPC)[2]，CTC是扩散到血液或淋巴系统的癌细胞[3]，外周血高CTC计数往往与较差的预后有关，在前列腺癌(PCa)、结肠癌、乳腺癌中，以计数≥5 个·7.5 mL-1可判断为预后不良，对预测患者的总生存时间及预后有着很好的效果[4]。前列腺癌是世界范围内男性第二常见的癌症，大多数前列腺癌相关死亡是由于局部晚期或转移性疾病所致[5-6]，目前也缺乏对转移性前列腺癌有效的治疗方案[7]，标准治疗方案为雄激素剥夺疗法，可控制和缓解癌症，但这种治疗方法仍不能满足CRPC患者。因此通过开发能够检测恶性肿瘤的方法来提高疾病早期诊断水平显得尤为重要，且有必要针对前列腺癌开发更特异的生物标志物，以此来改善和减少过度诊断、过度治疗。而外泌体能够参与肿瘤的发生、发展、转移，外泌体中的信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNAs)、非编码RNA、蛋白质、脂质等可以作为前列腺癌肿瘤标志物，通过检测尿液、血液等体液中的外泌体相关肿瘤标志物，能提高对疾病的早期预防。本文对外泌体在前列腺癌诊断中的应用研究进展进行综述，以期为进一步寻找外泌体内容物中更多特异性高的肿瘤生物标志物提供参考。

1 现阶段前列腺癌常用的诊断方法

目前一般将前列腺特异性抗原(PSA)检测与直肠指诊(DRE)相结合来筛查前列腺癌。PSA特异性存在于人前列腺腺泡及导管上皮细胞胞浆中，前列腺的结构致密，PSA几乎不可能进入血液中，当前列腺结构遭破坏，血清PSA水平升高，会显著增加PCa的风险[8]。但PSA水平升高并不是PCa所特有的，在患有良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎症的男性中，PSA水平也可升高[9-10]，PSA筛查的假阳性结果以及前列腺穿刺活检的副作用会产生过度检测、过度治疗，这无疑增加了患者的心理压力和医疗费用，甚至会产生不良反应[11]，当PSA水平超过4.0 ng·mL-1或DRE异常时，通常会怀疑是前列腺癌，但此标准可能会随着年龄、种族和个人生理状况的变化而变化[12]。PSA检测不能很好地区分前列腺癌或BPH[13]。目前对于PSA灰区患者，可利用游离PSA/总PSA比值来区分PCa与BPH，但其诊断敏感性和特异性不足，仅为75%和32%[14]。DENHAM等[15]认为游离PSA/总PSA的比值在临床中区分PCa和BPH方面并无优势，澳大利亚各州对PSA的要求与游离PSA/总PSA比值的要求有很大差异。PCA3也是目前应用十分广泛的前列腺癌尿液标志物，尿PCA3检测是美国食品和药物管理局(FDA)于2012年批准的，样本为DRE后的尿液，方法简单快捷。

2 外泌体简介

2.1 外泌体的作用机制

外泌体呈杯状或扁平球形态，直径在30～150 nm，外泌体参与细胞间的通讯、凝血、核酸与蛋白质转移[16-17]，同时也有类似抗原呈递细胞刺激体内免疫反应的作用[18]，外泌体与肿瘤的发生、发展、转移等过程密不可分[19]。外泌体有3种方式进入受体细胞：1)与细胞膜直接融合进入受体细胞；2)外泌体通过表面分子与受体细胞膜表面分子结合进入；3)受体细胞的内吞作用使外泌体进入并分泌外泌体内容物，进而发挥外泌体作用[20]。

前列腺癌中跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)与成红细胞病毒E26致癌物(ERG)融合基因已被证明与较差的预后相关[21]，可利用外泌体液体活检产品ExoDx Prostate IntelliScore(EPI)对PSA灰区患者的尿液外泌体中3个RNA(ERG、PC3、SPDEF)进行检测，避免不必要的穿刺活检。外泌体作为一把双刃剑，不仅能够帮助临床对疾病的检测，还能诱导免疫细胞的凋亡，降低人体免疫系统的功能，前列腺癌外泌体中的Fas配体通过诱导CD8+T细胞的凋亡，抑制T细胞反应，完成前列腺癌细胞的免疫逃逸[22]。

2.2 外泌体作为生物标志物的优势

前列腺癌患者血清外泌体可通过PKM2诱导骨髓间充质干细胞的CXCL12促进PCa肿瘤生长[23]，说明外泌体可能是前列腺癌潜在的肿瘤标记物。外泌体作为生物标志物有以下优点：1)肿瘤细胞释放的外泌体中含有肿瘤相关分子，可以在血液[24]、尿液[25]、精液[26]和母乳[27]等体液中进行分析；2)外泌体的脂质双分子层结构能很好地维持其中核酸的稳定性，不会被RNase降解；3)可以通过无创的方法从患者尿液、精液中提取外泌体；4)外泌体膜表面的特异性蛋白有利于反映其亲代细胞的生理、病理功能[28]。一些外泌体中包含的蛋白质，mRNAs、miRNAs、脂质已被确定为潜在的前列腺癌生物标志物[29]。

3 外泌体的内容物与前列腺癌的关系

3.1 mRNA

激肽释放酶3(KLK3)和雄激素受体剪接变异体7(AR-V7)这2种基因分别编码PSA和AR-V7。最近发现前列腺癌患者血浆外泌体中可检测到KLK3 mRNA，外泌体KLK3与血清PSA值有很强的相关性，AR-V7是前列腺癌特异性mRNA，通过检测外泌体AR-V7 mRNA的结果显示，在CRPC患者中，外泌体AR-V7的表达与性激素水平有关，AR-V7的表达与不良预后及对阿比特龙、恩杂鲁胺的反应降低相关[30-32]，还有研究[33]发现晚期前列腺癌患者尿液外泌体中的 AR-V7 mRNA水平和 AR-V7/AR-FL 比值较高。作为典型的PCa生物标志物PSA和PCA3，其mRNA的表达在尿液中PSMA(前列腺特异性膜抗原)阳性外泌体内明显升高，所以捕获尿液PSMA阳性外泌体检测PSA和PCA3 mRNA水平能提高Pca的诊断效率[34]。

3.2 miRNA

miRNAs是长度为18～22个核苷酸的单链非编码RNA，常通过与其目标蛋白编码mRNA结合来阻断基因表达，参与翻译的抑制和mRNA的降解[7]，外泌体携带了丰富的miRNA[5]，在外泌体所含的RNA中，成熟miRNA约占41.72%[13]，miRNA可通过癌基因或抑癌基因影响肿瘤的发生和进展，所以外泌体miRNA对于肿瘤早期诊断及预后的意义重大，将外泌体中miRNA应用于前列腺癌的液体活检，能提高PSA检测的特异性。miR-196A-5p和miR-501-3p在前列腺癌来源尿外泌体样本中表达下调[5]，PCa患者尿液外泌体中miR-145的水平相比BPH患者显著升高(P=0.018)，miR-145与Gleason评分显著相关，Gleason评分≥8分的患者相比于Gleason评分≤7分的患者，miR-145水平显著增加(P=0.02)，结合外泌体miR-145和血清 PSA，能比单独用PSA指标更好区分PCa和BPH，ROC曲线下面积(AUC)分别为 0.863和0.805[35]。另有研究[36]报道PCa患者尿外泌体中的miRNA-21和miRNA-375的表达上调，把两者结合起来鉴别前列腺癌也具有较大优势，AUC 为 0.872。

miRNA水平与肿瘤的分期有着密切的联系，外泌体miRNA具有预测侵袭性或局部性转移的潜力，可以区分正常、BPH和侵袭性前列腺癌。miR-888的过表达能使小鼠肿瘤生长加速，且尿外泌体miR-888在CRPC患者中的表达明显高于正常人和BPH患者[7]。外泌体miRNA 1246在侵袭性PCa中表达失调，侵袭性前列腺癌中外泌体miRNA-1246是正常人的31倍(P=0.026)，是BPH患者的23倍(P=0.035)[37]。

结合PSA与精液外泌体miR-142-3p、miR-142-5p、miR-223-3p的检测，可以准确地区分PCa与BPH患者，敏感性为91.7%，特异性为42.9%[26,38]，由此增加PSA筛选测试的特异性。

3.3 lncRNA

lncRNA(长链非编码RNA)能调节肿瘤抑制、转移、进展，lncRNA-Myu可以被外泌体包裹运输，在PCa细胞的细胞外环境中发挥作用，lncRNA-Myu水平在前列腺癌组织中显著上调，lncRNA-Myu通过竞争性结合miR-184上调c-Myc表达，从而诱导前列腺癌细胞的增殖，而Myu基因的敲除会减弱前列腺癌细胞的生长和迁移[39]。外泌体 lncRNA 水平可能有助于诊断 BPH 和 PCa。有证据证明，lncRNA在不同前列腺疾病中的表达也会不同，BPH组lncRNA-SAP30L-AS1水平明显高于PCa组(P<0.05)和对照组(P<0.000 1)，PCa组lncRNA-SChLAP1水平明显高于BPH组(P<0.000 1)和健康人(P<0.000 1)，lncRNA-SChLAP1水平会随着PCa的进展而增加[40]。

3.4 circRNA

circRNA(环状RNA)是一种单链闭合RNA，不具有5′端帽子和3′末端poly(A)尾巴，以共价键形成闭环结构，比线性RNA更稳定[41]。CircRNA与肿瘤的增殖、迁移有着重要的联系[42]。在前列腺癌患者中，能观察到外泌体circRNA-0044516表达显著上调，且circRNA-0044516的下调会抑制前列腺癌细胞的增殖和转移[43]。表明circRNA-0044516在前列腺癌的发展、转移中起着重要的作用。通过对前列腺癌患者尿液外泌体circ_0040507的水平进行检测发现，前列腺癌组患者尿液外泌体circ_0040507表达水平显著高于BPH组(t=4.165，P<0.001)，2组ROC曲线下面积为0.767(95%CI0.649～0.884)，4.12 copies·mL-1可作为尿液外泌体circ_0040507诊断前列腺癌最佳临界值，其灵敏度为68.6%，特异度为77.8%[44]。

3.5 蛋白

外泌体中的PSA可能成为前列腺癌筛查和早期诊断的新工具，以BPH患者作对照，发现只有PCa患者具有同时高水平表达PSA以及CD81的纳米囊泡[12]。与健康人相比，PCa患者血浆中外泌体CA IX(碳酸酐酶9)表达升高[45]， 其原因在于PCa外泌体呈酸性，肿瘤微环境的酸度导致PCa外泌体中CA IX活性增强，其表达上调[46]。

血清外泌体GGT(γ-谷氨酰转移酶)活性可能是潜在的PCa生物标志物，免疫组织化学分析显示，癌组织中GGT1的表达明显高于BPH组(P<0.01)，且前列腺癌患者血清中外泌体GGT的活性高于BPH患者(P<0.05)[47]。

血浆中CLDN3(封闭蛋白3)的水平随肿瘤分级的升高而升高。CLDN3是PC3外泌体的一种表面蛋白。Gleason 8级及更高级别的肿瘤患者外泌体表面蛋白CLDN3的表达与BPH或Gleason评分6～7分的患者相比明显增高 (P=0.029)[48]。

前列腺癌患者血液分离的外泌体高表达αvβ3整联蛋白，αvβ3从外泌体中转移至β3阴性受体细胞，与该疾病高度相关[49]，提示检测前列腺癌患者的外泌体αvβ3整合素可能是追踪前列腺癌进展的临床生物标记物。

3.6 脂类

外泌体中的脂质可能成为潜在的前列腺癌生物标志物。内体分选转运复合物(ESCRT)在外泌体的形成、释放中发挥了重要作用[50]，而有的外泌体是通过ESCRT非依赖机制产生的，中性鞘磷脂酶能够水解鞘磷脂生成神经酰胺，神经酰胺能不依赖ESCRT形成外泌体，是外泌体形成的关键脂质之一[51-52]。对15例前列腺癌患者和13例健康人群尿外泌体进行分析，发现磷脂酰丝氨酸(PS) 18：1/18：1和乳糖基神经酰胺(LacCer)(d18：1/16：0)最显著(P<0.001)，后者也是在前列腺癌患者与健康人群样本中比例差异最高，为95%，特定的脂质组合可以使前列腺癌的诊断得到更好的结果，根据LacCer(d18：1/16：0)与PS 18：1/18：1和PS 18：0/18：2与PS 18：1/18：1的组合的敏感性为93%，特异性为100%，AUC为0.989[29]。前列腺癌中外泌体相关肿瘤标志物见表1。

表1 前列腺癌中外泌体肿瘤标志物

4 外泌体与前列腺癌的治疗与预后

外泌体能够携带各种蛋白质以及核酸等物质的生物学特性，让它可能成为一种能够用于肿瘤治疗的载体，有证据表明，外泌体可能具有向癌细胞输送化疗药物的潜力。前列腺癌患者血清的外泌体，可以影响对多西他赛的反应，CRPC患者以多西紫杉醇为首选抗肿瘤药，而将紫杉醇装载到前列腺癌细胞来源外泌体中能增加了它的细胞毒效应，外泌体被PCa细胞持续摄取，通过内吞作用将紫杉醇输送到受体细胞，导致药物从细胞内释放，增强了药物能力[53]。

对前列腺癌患者的血浆外泌体进行高通量测序，结果显示外泌体miR-423-5p在前列腺癌骨转移中表达下调[54]。在前列腺癌骨转移过程中，外泌体miR-214能够记过Notch1信号通路增强了成骨细胞的分化[55]，外泌体miR-940的高表达也明显增强了前列腺癌骨转移[56]，骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-21-5p在PC3中的高表达能通过下调PHLPP2蛋白增强其增殖、EMT、迁移、侵袭能力[57]。

LNCAP细胞外泌体miR-26a的过表达能抑制PC-3细胞的增殖、迁移、侵袭能力[58]，人骨髓间充质干细胞衍生外泌体miR-205标高表达有助于抑制前列腺癌细胞并增强其凋亡[59]。随着前列腺癌临床分期的增加,外泌体miR-141的表达水平增加[60]，外泌体miR-141-3p能促进成骨细胞骨转移，缩短生存时间。前列腺癌细胞MDA-PCa-2b外泌体miR-141-3p能调节骨转移微环境，让成骨细胞活性增强[61]。上述研究表明，通过对前列腺癌这些外泌体内容物的检测可能为前列腺癌骨转移治疗和预后提供新的可能。

5 总结与展望

PSA结合外泌体内容物的检测能提高PCa诊断的特异性、敏感性，弥补PSA检测在假阳性、诊断敏感性、特异性这些方面的不足。外泌体的脂质双分子层结构使得它还能成为癌症靶向药物的载体，增加药效，说明外泌体不仅是一个有前途的肿瘤生物标志物，更是向人们提供了未来治疗癌症的新途径。目前外泌体的提取方法主要以超速离心法为主，优点是可以适用各种体液类型的标本，但缺点在于仪器昂贵、操作费时、需要的样本量较大，另外提取的方法还有外泌体沉降法(适合大样本量，操作简单，但周期长且纯度不高)，免疫亲和捕获法(纯度高，但成本高，产率低)、ExoQuick试剂盒法(操作简单效率高但使用成本也高)、超滤法(纯度一般且会因为滤膜的堵塞而有所影响)[16,62]，目前还未开发出一套效率高、特异性好、成本较低、适用于临床的标准方案，所以要进一步研究外泌体的提取方案，现有一种新型微流体系统能高效地提取外泌体，操作方便、速度快、纯度较高且成本较低，但目前临床测试很少，效果还有待验证[62]。若能将这些外泌体生物标记物整合到一个筛查方案中，也许能够提高PCa诊断水平，避免不必要的穿刺活检，帮助病患减轻疼痛，降低心理压力，减少费用。综上所述，值得进一步寻找外泌体内容物中更多特异性高的肿瘤生物标志物来提高PCa的诊断水平。