UHT 奶生产过程中晚期糖基化末端产物的抑制调控

薛海波，张洁菡，吴凡，王泽雨津，杨凰伶，谢琳，金思洋，彭英云，杨治风，陈义勇

（1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500；2.江苏梁丰食品集团有限公司，江苏张家港 215623；3.张家港市畜牧兽医站，江苏张家港 215600）

0 引 言

晚期糖基化末端产物( advanced glycation endproducts，AGEs)是在食品加工和贮藏过程中，通过美拉德反应生成的一类不可逆的共价化合物[1]。研究发现一些疾病如糖尿病及其并发症[2]、动脉硬化[3]、肾功能障碍[4]、心血管疾病[5]等是由AGEs 引起的。在食品热加工过程中，如巴氏杀菌、高温杀菌、烘烤和油炸等过程容易形成AGEs[6]。因此如何控制食品加工过程中AGEs 形成显得尤为重要。

UHT 奶经过超高温瞬时灭菌后，具有常温贮存时间长、销售方便的优点[7]。但是UHT 奶加工和贮藏过程中会产生对人体有害的产物AGEs，如何降低UHT 奶加工过程中产生的AGEs 是急需解决的问题。近年来，国内外学者研究发现黄酮类化合物除具有较好抗氧化作用外，同时具有显著抗糖基化活性，如芹菜素、芦丁、沙棘籽渣黄酮、玉米须黄酮等黄酮类物质对AGEs 具有较高抑制作用[8]，但是黄酮类物质应用于乳制品生产过程中的AGEs 的抑制作用未见报道。针对UHT 奶在生产和贮藏过程中AGEs 的形成因素及控制鲜见报道的现状，本研究以UHT 奶为对象，以UHT 奶中荧光性AGEs 含量为指标，考查加工条件（糖种类、糖添加量）、贮藏条件（温度和时间）以及添加食源性黄酮（槲皮素、芦丁、染料木素和儿茶素）对UHT 奶生产和贮藏过程中AGEs 形成的影响，以期控制UHT 奶生产和贮藏过程中的AGEs，旨在为UHT奶的安全生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料乳，江苏梁丰食品集团有限公司提供；槲皮素、芦丁、染料木素、儿茶素，陕西秦邦药业有限公司；磷酸氢二钠，上海国药集团化学试剂有限公司；蔗糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆，郑州百思特食品添加剂有限公司；蔗糖脂肪酸酯、单甘油脂肪酸酯，广州立胜贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

RT-6000 酶标仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司；AH-BASIC 均质机，安拓思纳米技术（苏州）有限公司；TG16-WS 高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Agilent LC-MS，美国安捷伦公司；HS-150 恒温恒湿培养箱，常州市金坛友联仪器研究所；超高温瞬时杀菌系统，上海沃迪智能装备股份有限公司；pH 计，瑞士METTLER TOLEDO 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 UHT 奶的制备流程

1.3.2 荧光性AGEs 含量的测定

根据文献[9]的方法进行荧光性AGEs 含量的测定。将2 mL UHT 奶和4 mL 甲醇混匀后在-80 ℃的条件下保存1 h，然后离心（1 3000 r/min，30 min），取0.3 mL上清液，在λex/λem=340 nm/465 nm 波长处测定荧光值,λex为荧光激发波长340nm 处的荧光值；λem为荧光发射波长465 nm 处的荧光值。以磷酸盐缓冲溶液作为对照，每组样品重复3 次。

1.3.3 糖种类对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响

原料奶经过检验后过滤、冷却、贮存，加入0.3%的复配稳定剂（蔗糖脂肪酸酯和单甘油脂肪酸酯），然后分别加入添加量为2%的果糖、蔗糖、葡萄糖和果葡糖浆，充分混匀后，经过过滤均质，然后在137 ℃条件下进行UHT 杀菌，杀菌时间4 s，然后取UHT 奶样品按照1.3.2 节的方法测定荧光性AGEs 含量，以磷酸盐缓冲溶液代替UHT 奶作为对照组，每组样品重复3 次。

1.3.4 糖添加量对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs的影响

原料奶经过检验后过滤、冷却、贮存，加入0.3%的复配稳定剂（蔗糖脂肪酸酯和单甘油脂肪酸酯），然后分别加入添加量为2%、4%、6%、8%的蔗糖，充分混匀后，经过过滤均质，然后在137 ℃条件下进行UHT 杀菌，杀菌时间4 s，然后取UHT 奶样品按照1.3.2 节的方法测定荧光性AGEs 含量，以磷酸盐缓冲溶液代替UHT 奶作为对照组，每组样品重复3 次。

1.3.5 贮藏温度和时间对UHT 奶中荧光性AGEs 的影响

原料奶经过检验后过滤、冷却、贮存，然后加入0.3%的复配稳定剂（蔗糖脂肪酸酯和单甘油脂肪酸酯）和2%的蔗糖，充分混匀后，经过过滤均质，然后在137 ℃条件下进行UHT 杀菌，杀菌时间4 s，灭菌完成后取出冷却至室温。将UHT 奶分别贮藏在4、25 ℃和37 ℃的培养箱中，于0、5、15、30、60 d 后取样，样品按1.3.2 节的方法测定AGEs 含量，以磷酸盐缓冲溶液代替UHT 奶作为对照组，每组样品重复3 次。

1.3.6 黄酮对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响

原料奶经过检验后过滤、冷却、贮存，然后加入0.3%的复配稳定剂（蔗糖脂肪酸酯和单甘油脂肪酸酯）和2%的蔗糖，充分混匀后，然后加入质量分数分别为4、6 和8%的槲皮素、芦丁、染料木素和儿茶素，经过过滤均质，然后在137 ℃条件下进行UHT 杀菌，杀菌时间4 s，然后取UHT 奶样品按照1.3.2 节的方法测定荧光性AGEs 含量，以磷酸盐缓冲溶液代替UHT 奶作为对照组，每组样品重复3 次。

1.3.7 数据处理

每组数据进行3 次平行试验取平均值，以“平均值±标准差”表示，作图采用Origin8.0 软件，利用spss20 软件处理数据软件进行方差分析和统计学分析（P＜0.05 表示存在统计学差异）。

2 结果与讨论

2.1 糖种类对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响

糖种类对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响结果见图1。从图1 可以看出，不同糖对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响较大。与蔗糖、葡萄糖和果葡糖浆相比，果糖对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的生成起到明显的促进作用（P＜0.05），蔗糖对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的生成的促进作用最小（P＜0.05），有利于降低AGEs 的生成。这4 种糖对AGEs 的生成促进作用由大到小依次为果糖、葡萄糖、果葡糖浆和蔗糖，促进AGEs 的生成的原因是因为单糖、低聚糖等受热自身发生焦糖化反应，产生丙酮醛（methylglyoxal，MGO），糖自身发生羟醛缩合和自氧化生成乙二醛（glyoxal，GO）[10]。MGO 和GO 又进一步与蛋白质结合，通过系列反应生成戊糖素、类黑素以及羧甲基赖氨酸等AGEs[11]。因此，本实验中的糖原料中单糖比如葡萄糖、果糖和果葡糖浆与蔗糖相比，更易发生糖基化反应形成荧光性AGEs，因此为了减少荧光性AGEs 的生成，蔗糖适宜作为UHT 奶加工过程中的糖原料。

图1 糖种类对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响

2.2 糖添加量对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响

在确定蔗糖作为适宜生产UHT 奶的原料的基础上，需要确定蔗糖合适的添加量。蔗糖添加量对UHT奶生产过程中荧光性AGEs 的影响见图2，从图2 可以看出，随着蔗糖添加量的增加，UHT 奶中荧光性AGEs 生成量逐步增高。当蔗糖添加量在0%～4%范围时，随着蔗糖添加量的增加，荧光性AGEs 生成量明显增加（P＜0.05），原因可能是随着糖添加量的增加，促进了蛋白糖基化反应。当蔗糖添加量在4%～8%范围时，随着蔗糖添加量的增加，荧光性AGEs 生成量有一定程度的增加，但是增加不明显（P＞0.05）。可能是因为随着蔗糖添加量（大于4%）进一步增加，形成荧光性AGEs 的量呈现基本饱和状态，进而达到最高值[12]。因此适宜的蔗糖添加量为2%。

图2 蔗糖添加量对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响

2.3 贮藏温度和时间对UHT 奶中荧光性AGEs 的影响

贮藏温度和时间对UHT 奶中荧光性AGEs 的影响见表1，从表1 可以看出，UHT 奶在贮藏60 d 内，荧光性AGEs 生成量随着贮藏温度的提高及贮藏时间的延长而增加。贮藏期在30 d 内，UHT 奶中荧光性AGEs 生成量随着贮藏温度的提高及贮藏时间的延长差异显著（P＜0.05）。在相同贮藏时间、温度不同条件下，UHT 奶中荧光性AGEs 生成量差异显著（P＜0.05）。在4、25 ℃和37 ℃条件下，15 d 内荧光性AGEs 生成量增幅较大，贮藏时间超过15 d，荧光性AGEs 生成量变化不大。25 ℃和37 ℃条件下，贮藏期为30 d 时，UHT 奶中荧光性AGEs 形成量分别是4 ℃条件下的1.07 倍和1.13 倍。原因可能是贮藏温度越高，促进了UHT 奶中糖类物质发生羟醛缩合，促进脂肪发生氧化，使得生成更多的1,2-二羰基化合物，导致产生越多的AGEs[13]。随着温度增加AGEs 产量差值增加量逐渐减小，是因为温度升高生成AGEs 所需的底物越来越少，温度增加导致AGEs 生成量增加不明显。由此，UHT 奶低温存放更有利于抑制蛋白糖基化，降低AGEs 的生成。

表1 贮藏温度对UHT 奶中荧光性AGEs 的影响

2.4 黄酮对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响

黄酮对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响见表2，从表2 可以看出，随着黄酮添加量的增加，UHT 奶中荧光性AGEs 生成量显著减少（P＜0.05）。4种黄酮对降低荧光性AGEs 的生成的效果排序为：芦丁＞槲皮素＞染料木素＞儿茶素。以芦丁为例，当添加量由4%增加到8%时，荧光性AGEs 的生成量降低了40.7%。黄酮能够抑制UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的生成，可能是因为黄酮能够结合中间产物1,2-二羰基化合物，从而阻断由1,2-二羰基化合物介导生成AGEs 的路径，另外可能是因为黄酮具有抗氧化作用，从而通过抗氧化作用阻断由自由基引发的合成AGEs 的路径[14-16]。

表2 黄酮对UHT 奶生产过程中荧光性AGEs 的影响

（续表2）

3 结 论

本文以UHT 奶生产过程中晚期糖基化末端产物调控为核心，阐明了在UHT 奶生产过程中，糖（包括糖种类、糖添加量）、贮藏条件（温度和时间）以及添加食源性黄酮（槲皮素、芦丁、染料木素和儿茶素）对UHT 奶中AGEs 生成的影响，结果表明糖对AGEs 的生成促进作用由大到小依次为果糖、葡萄糖、果葡糖浆和蔗糖，为了减少荧光性AGEs 的生成，蔗糖适宜作为UHT 奶加工过程中的糖原料。随着蔗糖添加量的增加，UHT 奶中荧光性AGEs 生成量逐步增高。因此，在UHT 奶加工过程中，减少糖的添加量可以大大减少荧光性AGEs 的形成。适宜的蔗糖添加量为2%。UHT 奶低温贮藏（4 ℃）、减少贮藏时间（贮藏时间不易超过15 d，）更有利于抑制蛋白糖基化，降低AGEs的生成。在UHT 奶加工过程中，食源性黄酮具有明显的抑制AGEs 的生成，并且随着黄酮添加量的增加，UHT 奶中荧光性AGEs 生成量显著减少（P＜0.05）。4 种黄酮对降低荧光性AGEs 的生成的效果排序为：芦丁＞槲皮素＞染料木素＞儿茶素。芦丁具有较好的抗糖化作用，适宜作为一种UHT 奶贮藏过程中天然有效的AGEs 抑制剂。

该研究聚焦UHT 奶生产过程中晚期糖基化末端产物调控，阐明了影响UHT 奶生产过程中影响荧光性AGEs 生成的影响因素，从而为有效调控UHT 奶生产和贮藏过程中有害物质的产生，为UHT 奶的安全生产提供了参考。