婴幼儿配方乳粉中亚硝酸盐检测方法的优化

亢美娟，黄思棋，刘芳玉，郑云鹏，冯海玲，罗华蓉

（1.黑龙江飞鹤乳业有限公司，黑龙江齐齐哈尔 161000；2.飞鹤（泰来)乳品有限公司，黑龙江齐齐哈尔 161000）

0 引 言

亚硝酸盐（nitrite），是含有亚硝酸根阴离子（NO2-）的盐。食用亚硝酸盐浓度高的食品可使婴儿患上“高铁血红蛋白症”[1-2]。因此GB 2762《食品安全国家标准食品中污染物限量》中对婴幼儿配方食品中亚硝酸盐的限量为2 mg/kg[3]。食品中亚硝酸盐的检测方法主要有分光光度法和离子色谱法、极谱法及液相色谱法[4]。国家标准GB 5009.33-2016 第二法为分光光度法，修改采用IDF 标准，但该方法中的前处理方式不能有效消除婴幼儿配方乳粉基质干扰，存在回收率偏低、重复性不好的问题[5-8]。本研究尝试采用固相萃取技术及活性炭吸附方式，除去样品中的对显色反应产生干扰的物质，并优化显色反应实验条件。建立准确度好、操作简便的分光光度法，为婴幼儿配方乳粉中亚硝酸盐的日常检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与材料

亚硝酸钠（≥99%），天津科密欧公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、盐酸、四硼酸钠、盐酸萘乙二胺，天津科密欧公司；对氨基苯磺酸、酸性活性炭，阿拉丁公司；Bond Elut C18 固相萃取柱6 cc/150 mg，美国安捷伦公司；Oasis HLB 固相萃取柱6 cc/150 mg，美国沃特世公司；Oasis MAX 固相萃取柱6 cc/150 mg，美国沃特世公司。以上试剂除标注的均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。

婴幼儿配方乳粉，分别购买2 个品牌的婴儿配方乳粉、较大婴儿配方乳粉和幼儿配方乳粉，市售。

1.1.2 仪器与设备

UV-1780 紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；HWS-28 型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；纯水仪，密里博公司；移液器，德国Effendorf。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液

亚硝酸钠标准储备液：亚硝酸钠标准溶液（质量浓度200 μg/mL，以亚硝酸钠计）：准确称取0.100 g于110 ～120 ℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解，移入500 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。亚硝酸钠标准使用液（质量浓度5.0 μg/mL）：吸取2.50 mL 亚硝酸钠标准溶液，置于100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，临用前配制。

1.2.2 试剂配制

亚铁氰化钾溶液（质量浓度106g/L）：称取106.0 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1 000 mL；乙酸锌溶液（质量浓度220 g/L）：称取220.0 g 乙酸锌，先加30 mL 冰乙酸溶解，用水稀释至1 000 mL；饱和硼砂溶液（质量浓度50 g/L）：称取5.0 g 硼酸钠，溶于100 mL热水中，冷却后备用；盐酸（浓度为0.1 mol/L）：量取8.3 mL 盐酸，用水稀释至1 000 mL；盐酸（浓度2 mol/L）：量取167 mL 盐酸，用水稀释至1 000 mL；盐酸（质量分数20%）：量取20 mL 盐酸，用水稀释至100 mL；对氨基苯磺酸溶液（质量浓度4 g/L）：称取0.4 g 对氨基苯磺酸，溶于100 mL 质量分数为20%盐酸中，混匀，置棕色瓶中，避光保存；盐酸萘乙二胺溶液（质量浓度2 g/L）：称取0.2 g 盐酸萘乙二胺，溶于100 mL 水中，混匀，置棕色瓶中，避光保存。

1.2.3 样品处理

称取试样5 g（精确至0.001 g），置于150 mL 具塞锥形瓶中，加7 mL 50g/L 饱和硼砂溶液，加入70 ℃左右的水约60 mL，混匀，于沸水浴中加热15 min，取出冷却至室温。转移上述提取液至100 mL 容量瓶中，分别加入3 mL 亚铁氰化钾溶液和和乙酸锌溶液沉淀蛋白质（滤液浑浊时可适当增加亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液的用量，同时做试剂空白），摇匀。加水至刻度，摇匀，放置30 min，除去上层脂肪，滤纸过滤后滤液备用，同时做试剂空白。

1.2.4 样液净化

活性炭净化方式：取上述滤液约50 mL 于150 mL锥形瓶中，加入活性炭1～1.5 g，震荡1 min。用滤纸过滤，弃去初滤液约3 mL，滤液备用，同样方式处理试剂空白滤液。

固相萃取净化方式：固相萃取柱的活化：依次用10 mL 甲醇、15 mL 水通过，静置30 min，备用。取上述滤液约10 mL，依次通过0.45 μm 水性滤膜针头滤器、Bond Elut C18 柱，弃去前面2 mL，收集流出液待测，同时做试剂空白。

1.2.5 亚硝酸盐测定

吸取0.00、40、80、120、160 μL 亚硝酸钠标准使用液分别置于10 mL 容量瓶中，分别加水至4.0 mL。取4.0 mL 上述样品净化液于10 mL 容量瓶中。样液与各标准溶液中分别加入0.4 mL 4g/L 对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min 后各加入0.2 mL 质量浓度为2 g/L 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，标准曲 线 各 点 质 量 浓 度 分 别 为：0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL。静置20 min，用1 cm 比色杯，以零管调节零点，于波长541 nm 处测吸光度，以吸光度为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标绘制线性回归曲线，根据标准曲线得到待测液中亚硝酸盐的浓度。活性炭净化方式：取上述滤液约50 mL 于150 mL 锥形瓶中，加入活性炭1～1.5 g，震荡1 min。用滤纸过滤，弃去初滤液约3 mL，滤液备用，同样方式处理试剂空白滤液。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择和优化

由于亚硝酸酸盐在碱性条件下易溶解且稳定性好，而婴幼儿配方乳粉样品体系呈酸性，用水溶解时呈弱酸性。采用饱和硼砂溶液溶解样品同时中和样品酸性，避免亚硝酸盐在酸性环境下及加热提取时造成损失。硼砂是硼酸钠的俗称，分子式为Na2B4O7·10H2O，为强碱弱酸盐，水溶液呈碱性，是含有多种硼酸根阴离子及聚硼酸根离子的体系，可将视为由2 分子硼酸和2 分子偏硼酸钠组成的缓冲体系。加入硼砂可维持提取液的碱性，有利于亚硝酸根离子的稳定存在[9]。通过水浴方式充分提取样品中的亚硝酸盐，选取温度为70、80、90、100 ℃水浴；分别提取10、15、20、30 min；考察水浴时间、温度对提取率的影响，从而选择出最佳实验条件，如图1 所示。实验结果表明在100 ℃和15 min时提取率最高，为98 %。用乙酸锌及亚铁氰化钾沉淀样液中的蛋白质[10-11]。定容过滤后，滤液采用活性炭或固相萃取技术净化，消除干扰。

图1 温度、时间对提取率的影响

2.2 活性炭净化方式实验条件的选择

婴幼儿配方乳粉经提取步骤得到的样液，由于存在有机物杂质干扰，影响亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与N-1-萘基乙二胺偶合形成紫红色染料的显色反应，导致检测结果与实际含量比偏低，回收率低。采用活性炭对样液进行处理能够得到良好的改善效果。活性炭的多孔结构提供了大量的表面积，通过物理吸附将介质中的杂质吸引到微孔上。活性炭除含有碳，而且还含有少量的化学结合、官能团形式的氧和氢，如羧基、羟基、脂类、醌类等[12-14]。活性炭的添加量影响净化效果的重要因素，选取3 种婴幼儿配方乳粉测试回收率考察活性炭的加入量对检测准确度的影响。样品经称样、加标、提取、沉淀、过滤后得到样液，吸取其中50 mL，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0 g 活性炭，实验结果表明在添加量达到1.5 g 时回收率达到最高并趋于稳定，平均回收率为96.2%，结果如图2所示。

图2 活性炭添加量对回收率的影响

2.3 固相萃取柱的选择

亚硝酸根离子化学式为NO2-，其在酸性条件下不稳定，易分解，具有一定氧化性，也具有还原性，能被强氧化剂氧化。提取净化过程宜在碱性环境下进行，避免使用强氧化剂和还原剂。分别采用聚合二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮固相萃取柱（HLB 柱）、混合阴离子交换固相萃取柱（MAX 柱）、和Bond Elut C18 固相萃取柱进行净化。HLB 柱和MAX 柱检测结果回收率均偏低，与不净化相比没有改善。通过Bond Elut C18 固相萃取柱净化后检测结果回收率得到显著的改善。Bond Elut C18 固相萃取柱具有C18 官能团的反向硅胶基SPE，具有疏水作用。反向填料是非极性吸附剂，可从极性基质中保留非极性化合物，键合硅胶吸附剂，增强了对非极性的组分有吸附作用，对水相基质中大部分有机物都能产生保留，如芳香油、脂溶性维生素、食品添加剂、碳水化合物、邻苯二甲酸酯、类固醇、水溶性维生素等，而盐能毫无保留地通过吸附剂[15]。Bond Elut C18 固相萃取柱使用前需进行活化，先使用强溶剂润湿小柱固定相，再用弱溶剂平衡、活化小柱。其过程为：依次用10 mL 甲醇、15 mL 水通过，静置30 min。取上述提取、沉淀后滤液约10 mL，依次通过0.45 μm 水性滤膜针头滤器、Bond Elut C18 柱，弃去前面2 mL，收集流出液待测，同时做试剂空白。如果样品流速太快，影响干扰成分在吸附剂中的保留，所以小柱流速控制在2～3 mL/min。

2.4 显色反应实验条件的确定

乳制品中亚硝酸盐的含量测定采用盐酸萘乙二胺分光光度法，其原理为：在酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，可与盐酸萘乙二胺偶合生成紫红色物质，在波长541 nm 处吸光度（Abs）为最大值，见图5，由校准曲线计算得出其含量。重氮化反应是芳香族伯胺和亚硝酸作用（在强酸介质下）生成重氮盐的反应，脂肪族重氮盐不稳定，容易自发分解；芳香族重氮盐较为稳定。在重氮化反应中，系统中的盐酸首先使芳香胺溶解，二是和亚硝酸钠生成亚硝酸，最后与芳胺作用生成重氮盐。重氮盐容易分解，只有在过量的酸液中才比较稳定。偶氮化是重氮盐与酚类、芳香胺作用生成偶氮化合物的反应，其中与酚类反应需要在碱性条件下，与芳胺反应则应在中性或弱酸性条件进行，反应原理如图3、图4 所示。影响重氮化和偶氮化反应的主要因素为反应时间[16-17]。样品净化后，依次加入对氨基苯磺酸溶液和盐酸萘乙二胺溶液，分别静止10、15、20、30、40、50 min 进行测试，实验结果表明，显色时间为20 min 时达到最大吸光度值，到40 min 内结果结果稳定，因此，实验条件确定为加入盐酸萘乙二胺并混匀后20～40 min 内用紫外分光光度计进行测试。

图3 重氮化反应

图4 偶氮化反应

图5 反应液紫外吸收图谱

2.5 标准曲线与检出限

吸取0、40、80、120、160 μL 亚硝酸钠标准使用液分别置于10 mL 容量瓶中。于标准管与试样管中分别加入0.4 mL 质量浓度为4 g/L 对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min 后各加入0.2 mL 质量浓度为2 g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，标准曲线各点质量浓度分别为：0，4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL。静置20 min，用1 cm 比色杯，以零管调节零点，于波长541 nm 处测吸光度，以吸光度为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标绘制线性回归曲线，如图6 所示。其线性方程为：y=0.0043x+0.0006，相关系数R=0.999，线性范围0.00～20.0 μg/mL。采用测定方法考察方法检出限，由于对婴幼儿配方乳粉中的亚硝酸盐含量有限量要求，选取空白样品基质25 个平行样，分别添加预估检出限质量分数0.4 mg/kg，该预估检出限浓度水平的检出概率为96%，定为检出限[18]。国家标准GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》第二法分光光度法中乳粉检出限为0.5 mg/kg。优化的比色法与国标方法比较灵敏度更高。

图6 亚硝酸盐标准曲线

2.6 回收率和精密度

以不含亚硝酸盐的婴幼儿配方乳粉为实验材料，分别采用活性碳净化方式和固相萃取净化方式处理样品，进行3 个浓度水平的加标实验，每个水平平行测定6 次，计算亚硝酸盐的加标回收率以及精密度（RSD），如表1 所示。回收率在91%～102%，RSD 在2.1%～3.4%。实验结果表明，两种优化的前处理方式均能得到良好的回收率和精密度，能够满足产品质量控制要求。

表1 婴幼儿配方乳粉回收率和精密度

2.7 不同处理方法检测结果比较

选择不同种类婴幼儿配方乳粉的空白样品分别采用活性炭和固相萃取净化方式处理样液后进行测试，同时与不经净化的样液进行比较，结果如表2 所示。实验结果表明，未经净化的样品检测结果与实际含量相比偏低，且不同种类样品检测结果存在较大差异。样液经活性炭和固相萃取净化方式处理后，能够有效消除基质干扰，检测结果准确度高，稳定性好。加标0.4 mg/kg 时，国标比色法（样液不净化检测结果）无检测信号，然而优化的比色法能够正常的检测其含量，因此显示出优化比色法的优势。加标1.0 mg/kg时，国标比色法（样液不净化检测结果）回收率为48%～75%，优化的比色法回收率为92%～102%，因此优化的比色法具有更好的准确度。

表2 不同处理方法婴幼儿配方乳粉检测结果

（续表2）

3 结 论

婴幼儿配方乳粉中亚硝酸盐的检测方法，目前主要有离子色谱法、分光光度法、流动注射法，其中离子色谱法用于检测婴幼儿配方乳粉，基质干扰大，难以得到准确的检测结果，且试剂耗材成本高；流动注射法需要购买专用仪器设备，检测成本高；分光光度法作为一种经典的检测方法应用范围广，但婴幼儿配方乳粉由于基质复杂，影响检测准确性，本文重点探讨了采用活性炭和固相萃取两种净化方式消除婴幼儿配方乳粉的基质干扰，并对实验条件如水浴温度、提取时间等进行了优化，通过实验确定了最佳显色反应实验条件，并对显色反应稳定性进行了考察。两种优化方法均能得到科学、准确、可靠的检测结果。与国标实验方法比较，具有更高的灵敏度和准确度，适合用于婴幼儿配方乳粉中亚硝酸盐含量的监测。两种净化方式操作简单，实验成本低，适用性强，容易推广开展。