双培养法提高涂片阴性分枝杆菌检出率的回顾性研究

陈晓丽，叶 龙，周典蓉，赵 越，袁凯旋，欧阳峰，顾 兵

(广东省人民医院 广东省医学科学院，广东 广州 510080)

分枝杆菌病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和非结核分枝杆菌(Nontuberculosismycobacteria)感染易感人群引起的全身性慢性传染病。世界卫生组织(WHO)发布的《2020年全球结核病报告》[1]显示，受新型冠状病毒肺炎疫情影响，全球结核病(tuberculosis，TB)病死率十多年来首次上升，全球约有150万人死于TB，病死率为15%，高于2019年的14%。据美国结核病监测系统(NTSS)报告，美国2020年TB发病率为2.2/10万，肺外结核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)约占所有TB患者的15%～20%[2-3]。目前，大部分实验室检测分枝杆菌的病原学方法为涂片萋-尼(Ziehl-Neelsen)法和分枝杆菌培养法，涂片法操作简单、快捷，但敏感性较低，而传统培养法耗时长，难以满足临床对早期可疑分枝杆菌感染快速诊断的需求。与涂阳分枝杆菌病相比，涂阴分枝杆菌病的鉴别仍然是诊断的挑战。本研究旨在探究实验室开展固-液双培养流程对提高涂片阴性分枝杆菌检出率的应用价值，并明确双培养流程的最佳标本应用范围，以期为提高实验室分枝杆菌的检出提供科学的参考方案。

1 资料与方法

1.1 研究资料 回顾性分析广东省人民医院2019年1月—2021年9月住院首诊普筛送检抗酸菌培养的患者，根据纳入标准和排除标准筛选出研究对象，并剔除重复患者送检的标本，按固体培养、液体培养、固-液双培养进行分组。另选取涂片分枝杆菌阴性，固体、液体或固-液双培养阳性的患者，将其按送检标本部位分为肺分枝杆菌组和肺外分枝杆菌组，分析两组患者的临床特征。纳入标准：均为初次涂片结果阴性患者。排除标准：已明确诊断分枝杆菌病的患者；艾滋病阳性、免疫系统疾病者；接受免疫抑制疗法的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 涂片染色 参照《全国临床检验操作规程》(第4版)操作步骤，痰、创面分泌物标本直接涂片，纤支镜冲洗液、支气管肺泡灌洗液、无菌体液等液体标本则取离心浓缩物涂片，组织标本经无菌研磨后取组织匀浆涂片，经紫外线照射30 min后采用萋-尼法染色，于普通光学显微镜油镜下观察计数[4]，染液购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.2.2 固体法培养 加入与呼吸道标本等量的4% NaOH溶液，取液化完成后的离心沉淀浓缩液100 mL接种罗氏斜面培养基(购自江门市凯林贸易有限公司)，无菌体液、组织标本则经前处理后取浓缩物及组织匀浆100 mL接种罗氏斜面培养基，置35℃培养箱孵育，每周观察并记录培养结果，连续培养至少8周。

1.2.3 液体法培养 加入与呼吸道标本1～2倍体积的N-乙酰-L半胱氨酸(NALC)+2%NaOH消化液混匀静置15 min，无菌体液、组织标本则经前处理后取浓缩物及组织匀浆1 000 mL，加入磷酸盐缓冲液至45 mL混匀中和，3 000×g、8～10℃离心15 min，取沉渣加入1 mL磷酸盐缓冲液制备标本混合液。取0.5 mL标本混合液加入已制备含有0.8 mL生长添加剂/抑菌剂混合液的MGIT培养管，颠倒混匀置入BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪(仪器及相关配套试剂购自美国BD生物技术有限公司)，设置仪器每60 min自动监测一次，随时跟踪处理仪器报阳结果，连续培养至少6周。

1.2.4 固-液双培养法 在液体培养的基础上，取其处理后的标本同时进行固体培养，工作流程及观察方法见图1。

1.3 统计学方法 应用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析，对于符合正态分布的连续变量以均数±标准差表示，若不符合正态分布，则以中位数(M)及百分位数(P25，P75)表示；对不符合正态分布的三组变量的两两比较，采用非参数秩和检验，α分割法，取P<0.017时差异有统计学差异；分类资料采用χ2检验或Fisher’s确切检验法，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况 共纳入6 492例患者，按不同培养法分组，可分为固体组3 234例，液体组1 938例，双培养组1 320例，253例培养阳性，检出率3.90%，各组培养阳性检出率分别为2.35%(76例)、4.54%(88例)、6.74%(89例)。三种培养法患者的临床症状分布比较，差异无统计学意义(χ2=9.338，P=0.053)。见表1。

表1 不同培养法患者的临床症状分布(例)

涂片分枝杆菌阴性，固体、液体或固-液双培养阳性的253例患者中男性143例，女性110例，平均年龄(58.34±18.47)岁。对各组检出时间(time-to-detection，TTD)进行分析，固体组TTD为34.65(24.37，43.10)d，液体组为10.45(5.33，18.08)d，双培养组为9.89(5.73，19.09)d；液体组和双培养组的TTD均低于固体组，差异有统计学意义(Z值分别为8.508、8.430，均P<0.001)；而液体组与双培养组比较，差异无统计学意义(Z=0.021，P=0.984)。

2.2 不同培养法患者肺和肺外分枝杆菌检出情况 固体组、液体组和双培养组肺分枝杆菌检出率分别为3.11%、6.02%、7.13%；肺外分枝杆菌检出率分别为1.02%、2.68%、6.09%。固体组、液体组肺分枝杆菌阳性检出率均高于肺外组，差异有统计学意义(P<0.001)，而双培养组肺与肺外分枝杆菌阳性检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同培养法肺分枝杆菌检出率比较，差异有统计学意义(χ2=26.513，P<0.001)；液体组、双培养组肺分枝杆菌检出率均高于固体组(均P<0.001)。不同培养法肺外分枝杆菌检出率比较，差异有统计学意义(χ2=35.618，P<0.001)；液体组、双培养组肺外分枝杆菌检出率均高于固体组(均P<0.001)；双培养组肺外分枝杆菌检出率高于液体组(P<0.001)。见表2。

表2 不同培养法肺和肺外分枝杆菌检出情况

2.3 涂片阴性培养阳性的标本类型分布 253例涂片阴性培养阳性患者送检的标本中肺标本188份，包括痰(30.44%)、纤支镜冲洗液(24.90%)和支气管肺泡灌洗液(18.97%)；肺外标本65份，主要由肺外组织(11.46%)、创面分泌物(5.93%)和胸腔积液(3.16%)构成。见表3。

表3 涂片阴性培养阳性的标本类型分布

2.4 253例患者的临床特征分析 253例涂片阴性培养阳性患者中肺分枝杆菌病188例(74.31%)、肺外分枝杆菌病65例(25.69%)。两组患者的性别分布比较，差异有统计学意义(P=0.025)。肺分枝杆菌病组咳嗽咳痰的比率较肺外分枝杆菌病组高(77.13% VS 21.54%)，差异有统计学意义(P<0.001)。肺分枝杆菌病组呼吸道疾病患者的比率较肺外分枝杆菌病组高(85.11% VS 38.46%)，差异有统计学意义(P<0.001)。肺分枝杆菌病组胸部CT表现有炎性渗出的比例较肺外分枝杆菌病组高(91.49% VS 72.31%)，差异有统计学意义(P<0.001)。肺分枝杆菌病组结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT)阳性检出率高于肺外分枝杆菌病组(87.23% VS 73.85%)，差异有统计学意义(P=0.012)。见表4。

表4 肺分枝杆菌组与肺外分枝杆菌组患者的临床特征比较

续表4 (Table 4， Continued)

3 讨论

结核分枝杆菌是TB的病原体，因感染部位不同，可分为肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)和EPTB，大多数感染表现为无临床症状、被控制的状态，称为潜伏性结核感染(LTBI)；小部分感染者出现有症状的活动性TB[5]。中国在WHO结核病负担最高的国家中排名第三(8.4%)[1]，因此，早期TB的检测与诊断对感染的预防与控制具有重要意义。

涂片镜检(萋-尼染色法)可辅助分枝杆菌病的诊断，其操作简单快速，对设施要求不高，检查费用低，是普筛的首选方法，但因敏感度不足、涂片质量不稳定等局限性，可能会延误诊断。培养作为诊断分枝杆菌病的金标准，目前大部分实验室常用的培养方法有固体培养法和液体培养法。固体培养法成本较低、操作简单，通过肉眼观察菌落形态即可得到初步的鉴别，广泛适用于各级实验室，但培养时间长，阴性结果需连续观察8周，阳性检出率受限于标本含菌量、培养前处理等。液体培养法敏感度相对较高，培养基添加的促生长因子能为分枝杆菌的生长提供充分的营养，检出率可提高10%，阳性TTD仅约14 d，但污染率偏高[6-7]，因此，需防止操作过程的污染。此法通过自动化检测设备，可以降低实验室生物安全风险，但同时也增加检查费用[8-9]。

加拿大结核病标准第七版[10]指出，每份送涂片镜检的标本都应设置在一种固体培养基和一种液体培养基中进行培养。Zhao等[11]研究结果显示，MGIT 960系统的平均TTD(11.78±5.16)d短于罗氏培养。本研究中，固体组TTD为34.65(24.37，43.10)d，液体组为10.45(5.33，18.08)d，双培养组为9.89(5.73，19.09)d，液体组和双培养组的TTD均低于固体组，差异有统计学意义(均P<0.001)；而液体组与双培养组比较，差异无统计学意义(P=0.984)。因双培养组大部分以液体培养先检出，故TTD与液体组差异不大。液体组分枝杆菌检出率为4.54%，优于固体组的2.35%，固-液体双培养组分枝杆菌检出率为6.74%，表明在本研究设计的双培养流程中样本前处理的优化也能提高传统固体培养的检出率。

对253例涂片阴性培养阳性患者的临床资料分析发现，肺分枝杆菌病患者中男性、咳嗽咳痰、患呼吸道基础疾病、胸部CT炎性渗出和T-SPOT阳性的比例较肺外分枝杆菌组高。肺外分枝杆菌病患者临床表现不典型，以椎体病变(疼痛和压痛)较为多见，其次为胸膜(发热)、肾及膀胱(尿频和尿痛)等。PTB患者早期临床体征也不明显，常表现干咳无痰，送检标本不合格导致涂片阴性，涂片阴性的TB在无规范诊断方案的情况下，误诊率可高达35%～52%，而EPTB临床表现多变，准确检测及诊断更具挑战性[12-13]。固体组、液体组肺分枝杆菌阳性检出率均高于肺外组，差异有统计学意义(P<0.05)。本研究中液体培养组肺分枝杆菌检出率较固体培养肺组高，与Thangavelu等[14]研究结果一致。固-液体双培养组肺外分枝杆菌检出率较另两组高，且耗时最短，固-液体双培养组中肺外分枝杆菌阳性检出率与肺组比较，差异无统计学意义，因此，优化标本培养前处理及工作流程可明显提高分枝杆菌检出率，尤其是肺外分枝杆菌的检出。Gröschel等[15]调查结果显示，美国青少年TB发病率为1.0/10万人，本研究结果显示青少年组TB患者数少，这与研究单位为大型综合医院中老年住院患者居多，导致入组年龄分段差距大有关。Snow等[16]研究指出，青少年患病占全球所有新发PTB病例的17%，因此，加强关注青少年生理、心理环境，对该病的研究和防控有重要作用[17-18]。

目前，我国分枝杆菌病诊疗现状是90%以上病患在综合医院首诊，在患者肺标本涂片找到分枝杆菌或培养阳性后即需转至专科医院完成鉴定及药敏试验方能确诊治疗。期望随着当代质谱、分子生物学等诊断技术的高速发展，未来综合医院乃至基层实验室在做好生物安全防护的基础上，都能快速完成分枝杆菌的鉴定及药敏试验，尽早对患者进行确诊治疗，有效遏制疾病的医院及社区传播。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。