冠突散囊菌与哈茨木霉在百香果储藏中的应用研究

魏宗游, 王 宇, 严云刚, 董 旋, 赵懿琛,2

(1.贵州大学茶学院， 贵阳 550025；2.山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550025；3.贵州省农业科学院果树科学研究所， 贵阳 550005； 4.安顺市农业科学院， 贵州 安顺 561000)

百香果(PassifloraedulisSims)是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属草质藤本植物，又称西番莲、巴西果、鸡蛋果，生长于热带地区，原产地为巴西。果实成熟后散发出多种水果香味，故称为“百香果”，享有“饮料之王”的美誉[1-2]。研究表明，百香果果汁含有多种必需氨基酸、维生素和微量元素[3]。百香果作为南方地区农村脱贫致富重点开发的经济果树，市场发展前景广阔[4-5]。目前，贵州省百香果种植面积为1.12万hm2，产业快速发展导致种苗质量参差不齐，一半种苗需从外省调入。大型百香果标准化种苗繁育基地欠缺，种苗质量良莠不齐，存在劣质苗、带病毒苗，严重制约产业发展。利用百香果优质实生苗可以有效解决产业发展瓶颈，实生选育也是开展种质资源创新的重要手段。但百香果种子外有一层囊膜，内含果汁，在分离选种时无法彻底清理干净，在贮藏中极易受到腐败真菌侵染导致劣变。受霉变环境影响的种子发芽率极低，严重影响选种效率。百香果为呼吸跃变型水果，采后易失水、皱缩，病原菌在表皮生长，导致腐败变质[6]。随着百香果产销半径的扩大及市场需求的增加，开展百香果采后保鲜技术研究，不仅能提升百香果采后商品性、延长货架期，而且对百香果优质种质资源的保存和创新具有一定的辅助作用。

近年来，利用拮抗微生物防治植物病害及水果保鲜储藏已成为研究的热点，其中，以哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)应用最为广泛[7]，哈茨木霉菌可以通过营养竞争、重寄生、细胞壁分解酵素以及诱导植物产生抗性等多重机制对多种植物病原菌产生拮抗作用，具有保护和治疗双重功效，是许多病原微生物的生防因子[8]，但就哈茨木霉的食品安全性评估目前未见报道。

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)俗称金花，属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌，营养要求低，适应性强，能利用多种氮源、碳源生长，是茯砖茶中的优势菌种及鉴别茯砖茶品质好坏的标准[9]。冠突散囊菌发酵可促进茶叶内含成分转化，改善产品香气滋味，且产生多种活性代谢物，具有抑菌、降血糖、调节肠道菌群、抗氧化等功效。其发酵产物苔黑酚除具有抗辐射作用外，对肠道致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及普通变形杆菌均具有显著的抑制作用[10-11]。

本研究分离并纯化百香果鲜果表皮真菌，分析真菌组成，用哈茨木霉和冠突散囊菌对分离出的真菌开展对峙抑菌试验，观察抑菌效果。同时配制哈茨木霉茶汤浸泡液、冠突散囊菌茶汤浸泡液、哈茨木霉与冠突散囊菌混合茶汤浸泡液和茶汤，将鲜果置入浸泡液中30 s，以未处理组作为对照，观察并记录采后鲜果的皱缩情况，以期为延长百香果的货架期提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试百香果品种为紫香1号，紫皮黄肉；2021年10月18日，采摘于贵州省果树科学研究所镇宁县良田镇坝草试验基地，选取面积为10 m2区域围绕4个方向和中心点，随机挑选成熟度、大小基本一致的果实60个，重复3次。

冠突散囊菌是由本实验室保存的菌种；哈茨木霉购于北京科展生物科技有限公司；黑茶购自中茶湖南安化第一茶厂有限公司。

1.2 方 法

1.2.1百香果表皮真菌分离纯化

百香果鲜果表皮3 g充分研磨成粉后，置于含有50 mL无菌生理盐水与玻璃珠的250 mL三角瓶内，200 r/min震荡培养60 min，制成悬液，将悬液稀释100倍，取100 μL稀释液涂布于孟加拉红培养基上用于分离[12]，26 ℃倒置培养14 d 或菌斑大于7 cm，选取长势良好的真菌菌落PDA进行纯化[13]。

1.2.2真菌鉴定及群落组成

以OMEGA-HP Fungal DNA Kit(Omega Bio-Tek USA)提取的DNA为模板，ITS 1 F(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS 4 R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物，使用KOD-Plus-Neo DNA Polymerase(TOYOBO东洋纺上海生物科技有限公司)扩增纯化真菌的ITS-序列，反应体系(20 μL)：ddH2O 8 μL，KOD buffer 2 μL，dNTP 2 μL，MgSO41.4 μL，正向和反向引物各0.6 μL，模板DNA 5 μL，KOD-Plus-Neo 0.4 μL进行PCR扩增，反应条件：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；68 ℃ 30 s，35个循环。PCR产物经Gel Extraction Kits (Omega Bio-Tek，USA)纯化回收后送美国英杰生命技术有限公司测序(Invitrogen)。NCBI blast N (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对分离纯化获得的菌株ITS序列进行比对，并下载相似序列，Clustalx(http://www.clustal.org)软件进行多重比对，使用MEGA 6.0软件构建NJ树，对分离获得的菌株进行分子鉴定[14]。利用如下公式计算真菌占比[15]。

1.2.3菌种活化

将冠突散囊菌、哈茨木霉及分离出的表皮真菌菌株接种于马铃薯 PDA培养基，置于25 ℃恒温培养箱中倒置暗培养，5 d后，用打孔器取菌斑边缘6 mm菌饼用作后续试验。

1.2.4平板对峙培养

用记号笔在 PDA 培养基平板背面分别标记对峙培养哈茨木霉、冠突散囊菌和病原菌所处位置(两菌种培养皿中线相对称，间隔3 cm)。直径为6 mm的哈茨木霉、冠突散囊菌和11种病原菌菌饼分别接种于上述对峙培养的PDA 培养基上。以单一接种6 mm菌饼的PDA培养基上生长的对应真菌作为对照。对峙培养和对照均置于25 ℃恒温培养箱中倒置暗培养，且每个试验重复3次。第3天开始采用“十字交叉法”测量菌落直径并拍照记录，根据如下公式计算生长抑制率[16]。

1.2.5浸泡液制备

1) 茶汤制备：参照GB/T 8305-2013茶水浸出物测定中茶汤制备方法提取茶汤，并置于121 ℃高压灭菌锅中灭菌20 min。

2) 冠突散囊菌及哈茨木霉菌液的制备：用6 mm无菌打孔器取一个活化的冠突散囊菌和哈茨木霉菌菌饼，分别置于装有250 mL液体PDA培养基的1 000 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min暗培养12 h。

3) 混配菌液制备：用6 mm无菌打孔器取一个活化的冠突散囊菌和哈茨木霉菌菌饼，分别置于装有250 mL液体PDA培养基的1 000 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min暗培养12 h。

4) 浸泡液制备：冠突散囊菌茶汤浸泡液、哈茨木霉茶汤浸泡液、哈茨木霉与冠突散囊菌混合浸泡液由冠突散囊菌菌液、哈茨木霉菌液、混配菌液分别与茶汤按体积比1∶3混合后28 ℃、180 r/min，5 min。

1.2.6百香果离体储藏实验

1) 取同一时期大小相似的鲜果，灭菌纸擦拭后分别置于哈茨木霉茶汤浸泡液、冠突散囊菌茶汤浸泡液、哈茨木霉与冠突散囊菌混合茶汤浸泡液和茶汤中30 s，以不浸泡为对照，25 ℃恒温储藏9 d，观察鲜果皱缩情况。

2) 皱缩度及皱缩指数。每次观察记录12个百香果皱缩面积，确定其皱缩度(0代表无皱缩；1代表0～25%皱缩；2代表25%～50%皱缩；3代表 50%～75%皱缩； 4代表75%～100%皱缩)， 设置3个重复；计算皱缩指数[17]。

3) 在室温下储藏14 d后，将鲜果从中间剖开，观察果肉情况。

2 结果与分析

2.1 真菌分离鉴定

从鲜果表皮中共分离得到23株真菌，经鉴定发现有9个属11种(表1)，其中耙齿菌属(Irpex) 1株，占菌落总数的4.3%；横断孢属(Strelitziana)1株，占菌落总数的4.3%；曲霉属(Aspergillus)2株，占菌落总数的8.7%；栓菌属(Trametes)2株，占菌落总数的8.7%；葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)2株，占菌落总数的8.7%；附球菌属(Epicoccum)2株，占菌落总数的8.7%；刺孢菌属(Subulicystidium)2株，占菌落总数的8.7%；枝孢霉属(Cladosporiumsp)有两个种共3株，占菌落总数的13%，镰刀菌属(Fusariumsp)有两个种共8株，占菌落总数的34.8%。从分离出的真菌数量及种类得出，镰刀菌属和枝孢霉属真菌是鲜果表皮主要真菌。

表1 百香果表皮真菌组成Table 1 Fungal composition of Passiflora edulis Sims epidermis

注：A为对照；B为冠突散囊菌；C为哈茨木霉。图1 对峙培养Fig.1 confrontation culture

2.2 抑菌效果

在PDA培养基上用哈茨木霉菌、冠突散囊菌与11种百香果表皮真菌对峙培养，计算对峙第7天时的抑菌率。从图1可以看出，培养到第7天时，哈茨木霉对分离的11种真菌均有不同程度的抑制作用，抑制率为23.8%～88.1%。其中对多毛毛栓菌(TH)的抑制作用最强，抑制率为88.1%。对可可毛色二孢菌(LT)、白囊耙齿菌(LL)、刺孢菌(SL)、横断孢菌(AS)、枝状枝孢菌(CC)、枝孢菌(CL)、厚孢镰刀菌(FC)、黄曲霉菌(AF)、高粱表球菌(ES)的抑制率分别为71.2%、69.4%、68.9%、68.5%、61.7%、56.6%、54.2%、43.3%、44.2%。对尖孢镰刀菌(FO)的抑制作用最弱，抑制率为23.8%。

冠突散囊菌对峙培养7 d时，其菌株直径在1.5～3.6 cm之间。有研究表明，冠突散囊菌20%蔗糖察氏琼脂培养基上生长较快，28 ℃培养7 d直径达37～40 mm，在不同培养基上的生长情况差异较大[18]。冠突散囊菌对黄曲霉菌(AF)、枝孢菌(CL)、多毛毛栓菌(TH)、厚孢镰刀菌(FC)、尖孢镰刀菌(FO)、枝状枝孢菌(CC)、横断孢菌(AS)没有抑制作用。对白囊耙齿菌(LL)、可可毛色二孢菌(LT)、长锥囊菌(SL)、高粱表球菌(ES)有抑制作用，抑制率分别为27.2%、25.8%、13.9%、16.1%。

注：A为冠突散囊菌茶汤浸泡液处理；B为哈茨木霉茶汤浸泡液处理；C为哈茨木霉与冠突散囊菌混合茶汤浸泡液处理；D为茶汤处理；E为对照。下同。图2 5组不同处理储藏9 d的鲜果Fig.2 Fresh fruit of 5 groups stored for 9 days under five different treatments

2.3 储藏效果

果实皱缩度是评价果实贮藏品质的重要指标之一，果实表皮失水皱缩会严重影响果实的外观品质，从而影响其商业价值。5组处理后的皱缩指数变化如图2、图3所示，结果表明，冠突散囊菌茶汤浸泡液处理后的鲜果0～4 d内果皮无皱缩现象，皱缩指数为0，第5天时部分鲜果表皮出现轻微皱缩现象，皱缩指数为1.17。随着储藏时间加长，表皮皱缩面积增大，第7天时皱缩指数为2，第9天时全部鲜果都出现皱缩现象，皱缩指数增长至2.33。哈茨木霉茶汤浸泡液处理后的鲜果在第3天时出现皱缩现象，皱缩指数为0.5，第9天时鲜果全部皱缩，皱缩指数为4。哈茨木霉与冠突散囊菌混合茶汤浸泡液处理的鲜果在第3天时出现皱缩，皱缩指数为1，在第7天时全部皱缩，皱缩指数为4。茶汤浸泡处理的鲜果在第3天时出现皱缩现象，皱缩指数为0.42，第7天时全部皱缩。对照组的鲜果在第3天出现皱缩，皱缩指数为1.7，第7天时全部皱缩。

图3 5组不同处理储藏9 d的皱缩指数Fig.3 Shrinkage rate of 5 groups stored for 9 days unbder different treatments

图4 储藏14 d果瓤情况Fig.4 Pulp condition after storage for 14 days

在5组处理中，第3天时哈茨木霉茶汤浸泡液、混配浸泡液、茶汤浸泡和对照4组处理均出现皱缩现象，皱缩指数对照组>哈茨木霉与冠突散囊菌混合茶汤浸泡液组>哈茨木霉茶汤浸泡液组>茶汤浸泡液组，随着储藏时间延长，各组处理的鲜果皱缩指数增加。第7天时，哈茨木霉茶汤浸泡液组的皱缩指数为3，对照组、哈茨木霉与冠突散囊菌混合茶汤浸泡液组和茶汤组鲜果表皮全部皱缩，皱缩指数为4。

储藏14 d后，冠突散囊菌茶汤浸泡处理的12个鲜果果瓤完好，与果籽都完整粘附在内壁上，果汁呈黄色，水分保持较好。茶汤浸泡液处理的2个鲜果果瓤与内壁分离，12个果汁呈黄色，水分保持不及冠突散囊菌茶汤浸泡处理的鲜果。哈茨木霉茶汤浸泡液处理的6个鲜果果瓤与内壁分离，4个果瓤颜色发暗。哈茨木霉与冠突散囊菌混合茶汤浸泡液处理的10个果瓤颜色发暗，出现异味。对照组鲜果果肉失水皱缩变质，部分果肉变黑，无可食性(图4)。

3 讨 论

新鲜采摘的百香果果实含水量高，如果不及时采取保鲜防腐措施，水分会不断蒸发，引发百香果果实霉变。有研究表明，采后2～3 d百香果就会因失水果皮发生皱缩，易受病源真菌侵染而腐烂[19]，严重影响其经济价值，并且霉变果实的种子发芽率也大幅度降低。因此，延缓果实皱缩，抑制果皮表面微生物生长对延长鲜果贮藏期，保存优良性状百香果种质具有重要意义。

本研究从百香果表皮中分离得到9属11种真菌，说明百香果采后表皮皱缩腐败很可能不是由单一菌种造成。本次分离获得的葡萄座腔菌属的可可毛色二孢菌是一种弱寄生菌，能引起百香果采后果腐病[20]。镰刀菌能引起植物果实、块茎、鳞茎等腐烂，是导致草果果穗和果实腐烂的致病菌[21]。枝状枝孢菌是导致脐橙腐烂病原菌之一[22]，并能引发香蕉煤污病[23]。高粱附球菌能引起卷心菜、烟草、百合等植物产生叶斑病[24]。黄曲霉是自然界中分布最广的腐生菌，可使农作物及产品变质、霉坏，对小麦、玉米、大米、花生污染最多[25]。

冠突散囊菌的代谢物能有效抑制细菌、真菌、放线菌的生长和繁殖[26-27]。目前，哈茨木霉是应用最广泛的生防真菌[28]，对植物病原菌有竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗性及协同拮抗作用[29]。本研究表明，冠突散囊菌和哈茨木霉对分离获得的百香果表皮真菌均有显著的抑制作用，且哈茨木霉的抑菌效果显著优于冠突散囊菌，说明这两种真菌均可用于百香果的储藏和保鲜。

储藏试验发现，哈茨木霉茶汤浸泡液处理储藏第9天时表皮完全皱缩，第14天时，6个鲜果果瓤与内壁分离，4个果瓤颜色发暗。鲜果经哈茨木霉茶汤浸泡液处理后，菌株在鲜果表皮快速繁殖，分泌纤维素酶，水解果皮中纤维素以获得能量来生长[30]，虽然果皮上其他菌种生长受到抑制，但哈茨木霉繁殖较快，大量消耗果皮中的碳氮源，并未达到预期保鲜效果。冠突散囊菌茶汤浸泡液处理储藏第9天时鲜果皱缩指数最小，第14天时，其果瓤保持较好，果汁呈黄色，无异味。菌株对营养要求低，适应性强，鲜果经冠突散囊菌茶汤浸泡液处理后，部分茶汤附着在鲜果表面，菌株利用茶汤内含物质繁殖。

冠突散囊菌和哈茨木霉对分离获得的百香果表皮真菌均有显著的抑制作用，由于哈茨木霉在鲜果表皮上繁殖较快，茶汤中的能源物质不能满足其生长，需要从鲜果表皮皮中获取能源，导致鲜果表皮皱缩。而冠突散囊菌利用茶汤内含物质能满足其9 d生长所需的能源，不需要从鲜果表皮中获取能源，使得储藏时间延长。本研究表明，冠突散囊菌可作为一种潜在的保鲜用拮抗微生物菌种。