蛋黄油中脂肪酸的气相色谱分析

汪毅恒，聂婷婷，方明玉，陈少泽，房 辉，曹晓琴

（江汉大学医学院药学系，湖北 武汉 430056）

鸡蛋富含蛋白质、脂质和微量元素等营养物质，其必需氨基酸的组成及比例与人体对氨基酸的需求接近，在人类的基础营养中发挥着举足轻重的作用[1]。其中的脂肪酸有一定的抗氧化作用[2]，在婴幼儿的大脑发育、免疫调节和疾病预防中都有重要的作用[3]。

目前，脂肪酸的检测技术有气相色谱法（Gas Chromatography，GC）、高效液相色谱法、近红外光谱法等[4-6]。但脂肪酸的沸点较高，在高温环境下不易挥发，在高温的柱环境下不易分离，对脂肪酸的测定有干扰[7]，因此需要开发适用于分析鸡蛋中脂肪酸的GC 方法，并对前处理进行优化。本文采用气相色谱法测定鸡蛋中蛋黄油的脂肪酸组分，并对其前处理方法进行优化，方法简便迅速，分离条件温和，可用于蛋黄油中脂肪酸的定性及定量测定。

1 实验材料

1.1 材料与试剂

37 种脂肪酸混合标准品。乙酸乙酯、正己烷、氢氧化钠、氢氧化钾、无水甲醇、95%乙醇、乙酸（均为分析纯）。超纯水（自制）。

1.2 仪器与设备

ME104E 型电子天平，中文液晶超声波清洗器，SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵，旋转蒸发器，WH-3型微型旋涡混合仪，DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器，CT-1A 型氮氢空气发生器，氮吹浓缩装置MTN-2800W（220V/50Hz），DHG-9030A 型电热恒温鼓风干燥箱，岛津GC-2014C 型气相色谱仪。

2 实验方法

2.1 蛋黄油样品的制备

采用乙醇萃取法制备蛋黄油样品[8]。称取约60g 蛋黄液，加入95%乙醇600mL，放入50℃的恒温加热磁力搅拌器中加热、搅拌（转速30r·min-1）。40min 后，将乙醇萃取液倒入布氏漏斗中减压抽滤，滤渣用95%乙醇洗涤数次。待漏斗过滤口没有液体滴出后，将抽滤瓶中的溶液转移至旋转蒸发瓶中55℃旋转蒸干，放入烘箱中50℃烘干至恒重，得到蛋黄油样品。

2.2 气相色谱条件

色谱柱：WAX（30m×0.25mm×0.25μm）。程序升温条件：初始温度100℃，保持3min，以3℃·min-1升至240℃，保持7min。载气（N2）流速10.6mL·min-1；进样口温度200℃；检测器温度250℃，不分流；进样量1μL。

2.3 甲酯化方法

取2.1 的蛋黄油样品约0.1g，用10mL 正己烷溶液溶解后，加入5mL 的KOH-甲醇（0.5mol·L-1）溶液，80℃下超声5min 进行甲酯化。向甲酯化后的样品中加入1mL 饱和NaCl 溶液和1mL 蒸馏水，再次漩涡震荡使其充分混合后，加入1mL 正己烷溶液。取上清液，用氮吹仪吹干，待正己烷挥发后定容至25mL，过0.45μm 有机滤膜。

3 结果与讨论

3.1 气相色谱法的建立

对气相色谱的升温程序进行优化。先采用升温程序①：柱初始温度为160℃，以5℃·min-1升至180℃，保持5min；再以5℃·min-1升至220℃，保持1min，结果见图1。再采用升温程序②：柱初始温度100℃，保持3min，以3℃·min-1升至240℃，保持7min，结果见图2。结果显示，由升温程序②得到的峰型较完整，分离度较高，因此确定采用升温程序②。

图1 升温程序①的谱图Fig.1 Chromatogram of Temperature procedure ①

图2 升温程序②的谱图Fig.2 Chromatogram of Temperature procedure ②

3.2 前处理方法的优化

3.2.1 甲酯化方法的选择

按照2.3 的方法，分别以KOH-甲醇（0.5mol·L-1）、NaOH-甲醇（0.5mol·L-1）作为甲酯化试剂进行处理。对比KOH-甲醇法与NaOH-甲醇法的色谱图，结果见图3。测定了其中的3 个物质1、2、3 的峰面积，结果见表1。从表1 可知，采用KOH-甲醇法处理后，样品所含的物质1、2、3 的浓度均较NaOH-甲醇法更高，表明KOH-甲醇法的处理效果更佳。

图3 KOH-甲醇法与NaOH-甲醇法的色谱图比较Fig.3 Results of chromatogram comparison of KOH-methanol method and NaOH-methanol method

表1 不同甲酯化的峰面积比较结果Table 1 Comparison of the area of different methyl esterification peaks

3.2.2 甲酯化仪器的选择

按照2.3 的方法，分别采用超声、冷凝回流、漩涡震荡进行甲酯化前处理，对比了各样品的色谱图，结果见图4。比较其中3 个物质（1、2、3）的峰面积，结果见表2。由此确定最佳的甲酯化处理方法为超声处理。

表2 超声、冷凝回流、漩涡震荡各峰面积的比较结果Table 2 Comparison of peak areas of ultrasonic,condensate reflux and vortex oscillation

图4 超声、冷凝回流、漩涡震荡色谱图的比较结果Fig.4 Comparison of ultrasonic,condensate reflux,and vortex shock chromatogram results

3.2.3 甲酯化影响因素的确定

分别研究了KOH-甲醇用量、超声时间、超声温度对甲酯化程度的影响。在前期实验的基础上，选取棕榈酸的峰面积作为评价指标，对甲酯化的影响因素进行正交实验，设置了3 个因素，分别为KOH-甲醇用量、超声时间和超声时间，每个因素分别选取3 个水平，结果见表3。

由表3 可知，KOH-甲醇用量、超声时间、超声温度对甲酯化程度均有影响。随着KOH-甲醇溶液的用量增加，样品的峰面积逐渐增大，10mL 时达到相对稳定。随着超声时间增加，样品的峰面积逐渐增大，10min 时达到相对稳定。超声温度对脂肪酸的甲酯化有显著影响，但对不同物质的影响不同。正交实验结果表明，超声时间对甲酯化的影响最大，R=71974；超声温度对甲酯化的影响最小，R=39555.6667。序号7 的结果最好，棕榈酸的峰面积为219849。最终确定脂肪酸的甲酯化条件为：KOH-甲醇用量为5mL，超声温度为80℃，超声时间为5min。

表3 甲酯化影响因素的正交实验结果Table 3 Orthogonal test results of influencing factors of methyl esterification

3.3 线性范围、检测限与定量限

蛋黄中多种脂肪酸的线性回归方程、相关系数（R2）、检出限（LOD）及定量限（LOQ）结果见表4。从表4 可知，浓度在2.5～300μg·mL-1范围内，9 种脂肪酸的线性关系良好，各组分检出限在1.1～4.5μg·mL-1之间，定量限在2.0～7.9μg·mL-1之间。

表4 9 种脂肪酸的线性回归方程Table 4 Linear regression equation of 9 fatty acids

3.4 准确度和精密度

空白样品按3 个浓度水平，添加37 种脂肪酸混合标准品，每个水平平行测定6 次，考察方法的回收率与精密度。以亚油酸为参照，记录峰面积，计算回收率和变异系数，结果见表5。由表5 可知，亚油酸在蛋黄中的平均回收率在79.8%～81.9%之间，变异系数≤11.2%，满足准确度和精密度的监控要求。

表5 不同样品中亚油酸的回收率和变异系数Table 5 Recovery and variation coefficient of linoleic acid in different samples

4 结论

本实验采用GC 法检测蛋黄油中的脂肪酸。对柱升温程序及样品的前处理条件进行了优化，前处理可较好地分离脂肪酸混合物，且分离度较高，峰形对称。本方法的专属性强，准确度及精密度高，各组分在一定浓度范围内线性关系良好，各项指标满足要求，可作为蛋黄油中脂肪酸测定的有效方法。