脓毒症患者外周血长链非编码RNA TMEVPG1水平及意义

徐娟，彭辉勇，蔡燕

(江苏大学附属人民医院 1. 重症医学科， 2. 医学检验科，江苏 镇江 212002)

脓毒症是重症医学科常见疾病，该病是由于宿主对于感染抵抗失调所引起的威胁生命的多器官功能异常[1-2]。免疫功能紊乱和凝血功能障碍是脓毒症发生发展的重要因素[3]。辅助性T细胞(Th细胞)在脓毒症免疫功能调节方面发挥重要作用[4]。有研究证实，Th1/Th2细胞及其细胞因子失衡与脓毒症疾病严重程度密切相关，具体表现为Th1细胞减少，Th2细胞增多，Th1/Th2比值下降[5]，但具体机制尚不完全清楚。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度大于 200个核苷酸的非编码RNA分子，几乎不编码蛋白，具有细胞和组织特异性[6]。TMEVPG1是一种位于干扰素(interferon，IFN)-γ基因下游约45 kb的非编码RNA。Collier等[7]研究发现TMEVPG1调控Th1 细胞分泌的IFN-γ。这一结果提示，TMEVPG1可能与脓毒症中Th1细胞失衡有关。因此，本研究旨在通过检测脓毒症患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中TMEVPG1的变化，并分析其与IFN-γ及临床参数的相关性，探讨其潜在诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2021年1月至12月江苏大学附属人民医院重症医学科收治的31例脓毒症患者。按照28 d预后分为存活组(n=25)与死亡组(n=6)。脓毒症组纳入标准：① 年龄≥18 岁；② 符合2016 年脓毒症/脓毒性休克治疗国际指南脓毒症诊断标准；③ ICU住院时间>3 d；④ 能获得完整临床资料者。排除标准：① 妊娠及哺乳期妇女；② 自身免疫病或长期服用免疫抑制剂、免疫功能低下者；③ 血液系统疾病者；④ 各种疾病终末期患者。另选取同时期来院体检健康者32例为对照组。对照组纳入标准：① 性别和年龄与脓毒症组匹配；② 无急性或慢性感染性疾病；③ 未服用免疫抑制类药物；④ 无自身免疫病、肿瘤、血液系统疾病。收集受试者相关临床资料，包括性别、年龄、白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、血小板计数，并计算中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)，中性粒细胞计数与淋巴细胞和血小板计数比值(N/LPR)，急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ)，C反应蛋白，降钙素原。

本研究方案经江苏大学附属人民医院伦理委员会批准，并在征得所有受试者的书面知情同意后，在江苏大学附属人民医院采集血液样本进行实验。本研究中描述的所有操作都符合生物安全和机构安全程序。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs分离 用EDTA-K2静脉采血管(美国BD公司)采集静脉血2 mL，3 000 r/min，离心10 min后弃去血浆，剩余血细胞加入1 mL磷酸盐缓冲液混匀，按照1 ∶1比例加入含Ficoll-Hypaque人淋巴细胞分离液(中国天津灏洋生物公司)的离心管中，按照试剂盒使用说明分离人PBMCs，-80 ℃储存备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测TMEVPG1和IFN-γmRNA水平 PBMCs中加入500 μL RNA裂解液(Lysis缓冲液)，根据RNA快速提取试剂盒(中国奕杉生物公司)要求提取总RNA。提取的RNA使用NanoDrop®ND-1000紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)检测RNA浓度和纯度，以D(260 nm)/D(280 nm)和D(260 nm)/D(230 nm)比值评估RNA纯度。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)合成cDNA。采用TB GreenTMPremix EX TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司)进行实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)。引物序列，TMEVPG1：上游5′-GCTGATGATGGTGGCAATCT-3′，下游5′-TTAGCAGTTGGTGGG-CTTCT-3′；IFN-γ：上游 5′-GAGTGTGGAGACCATCAAGGA-3′，下游5′-TGTATTGCTTTGCGTTGGAC-3′；β-肌动蛋白：上游5′-GTCGTCGCTGCTGCCTT-TCC-3′，下游 5′-CAGTGCGTGCCTTGCCTCA-3′。使用β-肌动蛋白作为内参基因，采用2-△△Ct值计算相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 研究对象的临床特征

31例脓毒症患者纳入本研究，其中男24例，女7例，年龄37～86岁，平均年龄58岁。32例年龄和性别匹配的健康志愿者为对照组，其中男22例，女10例，年龄38～71岁，平均年龄55岁。脓毒症组的白细胞计数、中性粒细胞计数、NLR、N/LPR及C反应蛋白水平均高于对照组，而LYM和PLT低于对照组。脓毒症组和对照组主要临床资料统计见表1。

表1 脓毒症组和对照组主要临床资料统计

2.2 脓毒症患者外周血中TMEVPG1水平分析

如图1A所示，脓毒症组PBMCs中TMEVPG1水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。与存活组相比，脓毒症死亡组中TMEVPG1水平无统计学差异(图1B)。采用Spearman相关性分析进一步分析TMEVPG1与APACHE Ⅱ评分的关系，结果显示，脓毒症患者TMEVPG1与APACHE Ⅱ评分呈显著负相关(r=-0.483，P=0.006)，见图1C。

A：脓毒症组和对照组PBMCs中TMEVPG1水平比较；B：脓毒症存活组和死亡组的TMEVPG1水平比较；C：脓毒症患者TMEVPG1水平与APACHE Ⅱ评分相关性分析

2.3 脓毒症患者TMEVPG1与NLR、N/LPR相关性分析

相关性分析显示，脓毒症患者PBMCs中TMEVPG1与NLR(r=-0.397，P=0.027)及N/PLR(r=-0.359，P=0.047)均存在显著负相关关系。见图2。

图2 脓毒症患者PBMCs中TMEVPG1水平与NLR、N/LPR相关性分析

2.4 脓毒症患者外周血中IFN-γ mRNA水平的变化

脓毒症患者PBMCs中IFN-γmRNA水平明显低于健康对照者(图3A)，差异有统计学意义(P<0.001)。相关性分析显示，脓毒症患者中TMEVPG1与IFN-γmRNA呈显著正相关(r=0.436，P=0.014)，见图3B。

A：两组PBMCs中IFN-γ mRNA水平比较；B：脓毒症患者PBMCs中TMEVPG1与IFN-γ mRNA相关性分析

2.5 TMEVPG1对脓毒症的诊断价值评估

ROC曲线分析TMEVPG1作为脓毒症诊断标志物的价值，结果显示，TMEVPG1可以将脓毒症组和对照组区分开，其曲线下面积为0.84，95%CI为0.75～0.94；最佳截断值为0.52时，敏感度为70.97%，特异度为81.25%(图4)。结果表明，TMEVPG1具有作为脓毒症诊断分子标志物的潜能。

图4 TMEVPG1的ROC曲线分析

3 讨论

据GENCODE的统计数据表明，人类基因组包含超过16 000个lncRNAs基因，然而大多数lncRNAs功能未被鉴定，使之成为转录副产物[8]。目前，越来越多的研究表明lncRNAs具有重要的分子作用和细胞功能[9-10]。根据其定位不同，lncRNAs主要分为增强和抑制蛋白质编码基因转录或翻译两大类功能[11]。其中，定位于细胞核的lncRNAs主要以顺式或反式作用形式调控基因表达[12]；定位于细胞质的lncRNAs主要发挥内源性竞争RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的作用，通过竞争性结合microRNA调节基因的表达[13]。研究发现，TMEVPG1是一种Th1特异性的lncRNA，可与T-bet一起提高鼠Th1细胞中IFN-γ的水平[7]。Wang等[14]同样发现TMEVPG1能够促进人Th1细胞中IFN-γ的表达。然而，TMEVPG1在脓毒症患者中的作用尚不清楚。本研究证实，脓毒症患者PBMCs中TMEVPG1表达降低，且与同样低表达的IFN-γ呈显著正相关。IFN-γ基因编码一种可溶性细胞因子IFN-γ，属于Ⅱ型干扰素，可由Th1细胞等分泌[7]。IFN-γ与干扰素受体结合，增强吞噬细胞介导的抗感染免疫，尤其是抗胞内病原体感染[4]。因此，推测脓毒症中Th1细胞及IFN-γ水平降低可能与TMEVPG1表达降低有关。

Th1细胞是一类分泌IFN-γ、IL-2、TNF等细胞因子的CD4+T细胞亚群，介导炎症反应[4]。研究表明，Th1/Th2失衡通过破坏机体炎症因子平衡导致脓毒症病情加重[15]。王建峰等[16]证实，脓毒症患者体内存在Th1向Th2漂移，导致免疫抑制状态。杨卫星等[5]发现，脓毒症患者Th1/Th2比值下降，且与病情严重程度有关，而治疗后Th1向Th2转化得以纠正。APACHE Ⅱ评分是评估脓毒症病情严重程度的常用指标，并与患者预后密切相关[17]。本研究结果显示，脓毒症患者PBMCs中TMEVPG1水平与APACHE Ⅱ评分呈显著负相关。这表明，脓毒症患者TMEVPG1表达越低，APACHE Ⅱ评分越高，患者病情越严重。本研究同时比较了脓毒症死亡组和存活组TMEVPG1的差异，结果显示死亡组中TMEVPG1水平略低于存活组，但差异无统计学意义。分析其原因，一方面TMEVPG1仅能反映脓毒症患者体内Th1细胞情况，不能反映其他炎症细胞(如Th17、Treg)的变化；另一方面可能由于纳入的样本量太少，这需要进一步扩大样本量进行深入机制研究。

中性粒细胞是早期免疫应答细胞，参与脓毒症患者体内病原微生物清除和免疫防御作用[18]。淋巴细胞是机体细胞免疫和体液免疫的重要组成部分[19]，NLR反映外周血中性粒细胞和淋巴细胞的平衡状态。研究显示，NLR与脓毒症患者体内免疫功能活化情况及患者预后密切相关[20-21]。脓毒症患者常合并凝血功能异常，而NLR不能反映机体凝血功能变化，通过加入血小板参数，N/LPR很好地反映机体凝血功能和免疫状态[22]。刘大东等[23]证实，N/LPR对脓毒症28 d病死率预测价值优于NLR。本研究发现，脓毒症患者PBMCs中TMEVPG1水平与NLR和N/PLR均存在显著负相关关系，这提示，TMEVPG1与脓毒症患者病情及免疫状态密切相关。王子宏等[24]研究发现，中性粒细胞/白蛋白比值具有预测脓毒症患儿死亡风险的价值，本研究通过ROC曲线分析发现，TMEVPG1具有作为脓毒症生物标志物的潜在价值，能够一定程度上反映机体的免疫状态。

综上所述，脓毒症患者PBMCs中TMEVPG1显著降低，并可能通过调节IFN-γ参与脓毒症的疾病过程。TMEVPG1是脓毒症潜在的生物标志物，但是还需要更大脓毒症群体研究来进行验证。