糖皮质激素联合促肾上腺皮质激素对脓毒症休克大鼠肾上腺皮质功能的影响*

揭凤英 徐玲文 董 芳 王华兵

脓毒症是宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍[1]，流行病学的相关研究显示，近年来，全球每年因脓毒症死亡患者高达1 000万例[2]，降低脓毒症患者的病死率依然是目前重症医学的难点与挑战。糖皮质激素(GC)作为指南推荐脓毒症尤其是脓毒性休克的辅助疗法之一，在临床上已经应用近40余年，但其确切疗效以及能否让脓毒症患者获益始终存在争议[3,4]。促肾上腺皮质激素(ACTH)是由垂体前叶分泌的多肽类激素，通过结合ACTH受体激活cAMP信号转导通路，促进以GC为代表的类固醇激素合成与分泌。目前已有研究[5]表明，外源性ACTH副作用远小于外源性GC， ACTH联合GC作为单纯GC的替代治疗方案对脓毒症的治疗，可减少GC的用量，副作用更小，或可有着更广泛的应用前景。本研究通过建立脓毒症休克大鼠模型，研究GC联合ACTH对脓毒症休克大鼠肾上腺皮质功能的影响，为GC联合ACTH对脓毒症休克的临床治疗提供理论依据。

1 研究方法

1.1 主要仪器和试剂

低温超速离心机(德国Eppendorf公司)、PCR自动循环仪(美国Bio-Rad公司BIO-RAD CFX 96 TOUCH)、微型台式离心机(德国Eppendorf公司)、电子天平(中国国豪斯国际贸易有限公司)、电泳槽(美国Bio-Rad公司)、漩涡混合器(中国 其林贝尔仪器制造有限公司)、机械对流型超级恒温水浴锅(美国Thermo公司)、酶标仪(Molecular DevicesSpectraMax i3)、倒置显微镜(日本Olmpus公司)等设备中心实验室均配备；促肾上腺素皮质激素(SIGMA M7907)、地塞米松(湖北天药药业股份有限公司52009181)、Trizol试剂(ambion343903)、二乙基焦碳酸盐(DEPC)、鼠促肾上腺皮质激素RNA逆转录试剂盒(ThermoFisher 701293)、DNA酶(Vazyme 7E552H1)试剂盒检测试剂盒等均购自武汉华美生物工程有限公司。

1.2 动物模型建立与分组

7周龄SD健康雄性大鼠，体质量250-350g，清洁级，72只，由我院实验动物中心提供。本研究采用经典的盲肠结扎穿孔(CLP)术建立脓毒症模型[6]。腹腔注射3%戊巴比妥钠(30-50mg/kg体质量)麻醉，腹部皮肤75%乙醇消毒，腹部下1/4象限皮肤中线纵切口3-4cm，逐层打开腹壁暴露腹腔，找到盲肠取出腹腔外，在盲肠1/2 处用3-0丝线结扎盲肠(结扎50%)，在结扎盲肠部分的中间用单针头(18G)由系膜侧指向系膜对侧贯穿性穿孔，从穿孔内轻轻挤出一小点粪便(半个米粒大)到盲肠外，纳回盲肠，逐层缝合腹壁。在右侧腹股沟作切口，分离股动脉，远心端用0号丝线结扎，近心端插入肝素化22G套管，0号丝线结扎，套管另一端经压力换能器后连接于血压监护仪检测平均动脉压(MAP)。观察动物反应有无萎靡、寒战、腹胀、腹泻及竖毛等表现，生命体征检测仪连续动态监测MAP和心率变化，以MAP下降至少50%作为休克模型制作成功的标志。采用随机数字表法将大鼠分为4组(每组各18只)：①假手术组(S组)：单纯开腹，取出盲肠再放回腹腔，关闭腹腔，其余处理同CLP术；②脓毒症组(CLP组)：CLP术建立脓毒症模型；③地塞米松组(DE组)：CLP后6h肌肉注射地塞米松1mg/kg；④地塞米松+促肾上腺皮质激素组(DA组)：CLP后6h肌肉注射地塞米松0.5mg/kg+促肾上腺皮质激素0.8μg/kg，所有手术操作在我院动物实验中心的SPF手术间进行。

1.3 观察指标和方法

1.3.1 7天累积病死率：模型结束后每组随机取10只大鼠，观察术后7天死亡情况，计算7天累积病死率。

1.3.2 血清皮质醇(COR)、皮质酮(CORT)及ACTH含量检测：每组分别于药物治疗后6h、12h、24h、48h各处死2只大鼠，留取血液标本。在右侧腹股沟分离股动脉，酒精棉球消毒血管表面，用10ml一次性注射器(内用1%肝素钠浸润过)抽取大鼠动脉血5-8ml(尽量多取)，立即放入含有1%肝素钠0.1ml 的抗凝管冰浴，30min内，在冰冻离心机4℃下离心力450g，离心20min，取血浆-20℃保存，待样本收集完成后集中检测。检测前将分离的外周血标本于-20℃冰箱取出，采用ELISA检测COR、CORT及ACTH含量，严格按照试剂盒说明书步骤检测。

1.3.3 RT-PCR检测垂体组织ACTH mRNA的表达：大鼠留取血液标本后，迅速剪取垂体组织放入冻存管中，液氮保存。提取垂体组织总RNA，RT-PCR法从基因水平检测垂体组织ACTH mRNA的表达。逆转录及扩增步骤按照试剂盒(美国Promega公司)说明书进行；扩增体系25μl，ACTH、β-actin基因上、下游引物由北京奥科生物有限公司合成。扩增参数为：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；循环完毕后72℃延伸6min。琼脂糖凝胶电泳显色、成像，Marker确定产物大小，Gel-ProAnalyzer 4软件进行分析，以β-actin作为内参照；以目的基因与内参照的灰度(A)值比值表示目标mRNA的相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠7天累积病死率

各组大鼠7天累积病死率差异有统计学意义(χ2=28.60，P<0.01)。与S组比较，余3组7天累积病死率均升高(χ2>28.60，P<0.01)，与 CLP 组比较，DE组和DA组7天累积病死率均明显下降(χ2均>8.22，P<0.01)，同时，DA组的死亡率较DE组下降更明显(χ2=4.45，P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠血清COR、CORT及ACTH水平

与S组相比，CLP组、DA组和DE组COR、CORT及ACTH水平在6h、12h、24h、48h均明显升高，差异具有统计学意义(t均>21.03,P<0.01)。与CLP 组相比，DA组和DE组COR、CORT及ACTH水平在各检测时间点均明显升高，差异有统计学意义(t均>4.68，P<0.05)。与DE组相比，DA组COR、CORT及ACTH水平在实验6h和12h变化趋势不明显(t均<0.33,P>0.05)，24h和48h DA组COR、CORT及ACTH水平明显升高，差异有统计学意义(t均>3.11，P<0.05)。见表2、表3、表4。

表2 各组大鼠血清COR水平比较

表3 各组大鼠血清CORT水平比较

表4 各组大鼠血清ACTH水平比较

2.3 各组大鼠垂体ACTH mRNA的表达

与S组相比，CLP组、DA组和DE组垂体ACTH mRNA表达水平在各检测时间点均明显下降，差异具有统计学意义(t均>6.14，P<0.05)。与CLP组相比，DA组和DE组垂体ACTH mRNA表达水平在6h和12h差异无统计学意义(t均<0.88，P>0.05)，24h后ACTH mRNA表达水平明显升高，差异具有统计学意义(t均>8.48，P<0.01)。与DE 组相比，DA组垂体ACTH mRNA表达水平在24h后明显升高，差异具有统计学意义(t均>10.25,P<0.01)。见表5。

表5 各组大鼠垂体ACTH mRNA的表达水平

3 讨 论

Marik等[7]将机体在危重病状态下的HAP轴功能障碍、发生皮质醇分泌相对不足及外周组织对皮质醇抵抗的病理生理改变,称之为危重病相关性皮质激素不足(CICI)，为GC在危重症中的临床应用奠定了理论依据。在脓毒症治疗中，GC可通过改变IL-1、IL-3、IL-5、IL-6和TNF-α等炎性因子的基因转录，进而抑制炎性因子的合成，产生强大的抗炎效果[8]，亦可通过影响核因子-κB(NF-κB) 通路抑制多种细胞因子、黏附分子、免疫受体以及应激反应蛋白的转录[9]。1991年Rothwell等[10]首次报道采用ACTH刺激实验评价脓毒症休克患者肾上腺皮质功能，并提出了相对性肾上腺概念障碍(RAI); 2000年Annane等[11]报道采用“标准剂量”(250μg)ACTH刺激实验，并以皮质醇增值≤90μg为判断RAI的指标，为GC治疗脓毒症休克患者提供了理论依据。同时，该研究指出，肾上腺功能状态与脓毒症休克患者预后及病死率明显相关，脓毒症休克患者合并RAI时病死率明显增加。从近年来的研究来看，危重症患者肾上腺功能状态与预后及病死率的关系尚无一致观点，RAI并不总是导致危重症患者的病死率增加。Salluh等[12]Meta分析发现存在CICI患者与非CICI患者病死率无明显统计学差异。Brander等[13]采用小剂量ACTH刺激试验报道剖腹手术中有较高的RAI发生率，但RAI发生率与术后并发症及患者的预后无关。以上研究结果均说明，在脓毒症休克的治疗中，无论从基础探索还是临床研究角度，无论是单纯GC的替代治疗还是ACTH联用GC替代治疗，均存在一些亟待解决的重要科学问题。

本研究通过建立脓毒症大鼠模型，采用1mg/kg GC的常规剂量与GC 0.5mg/kg+ ACTH 0.8μg/kg进行对比研究，分析两种治疗方案对脓毒症休克大鼠肾上腺皮质功能的影响。结果显示，较单纯GC治疗，GC联合ACTH治疗大鼠7天累积病死率呈下降趋势；在脓毒症早期(12h内)，两种治疗方案大鼠血清COR、CORT及ACTH水平变化趋势不明显，但当大鼠出现脓毒症休克后(实验24h后)，GC联合ACTH治疗较单纯GC治疗大鼠血清COR、CORT及ACTH水平明显升高，同时垂体ACTH mRNA表达水平明显升高。HPA轴是神经-内分泌-免疫网络的枢纽，在应激反应中起关键性作用。感染发生时，HPA轴被激活，产生以肾上腺分泌皮质醇增多为主的应激反应，致使循环中糖皮质激素水平增高，这种活化可以维持内环境稳定，提高机体抵抗力，但当感染症状持续加重，机体应激反应无法维持并与激素水平相适应时，就会出现皮质醇激素功能减退，进而导致脏器及系统损伤甚至衰竭[14]。

综上所述，当大鼠出现脓毒症休克后，GC联合ACTH治疗较单纯GC治疗，不仅能减少GC的使用剂量，而且能更好的提升脓毒症休克大鼠COR、CORT及ACTH的水平，并改善垂体ACTH mRNA的表达，从而改善脓毒症休克大鼠肾上腺皮质功能，最终能更好的降低脓毒症休克大鼠7天病死率。然而，GC联合ACTH对脓毒症休克大鼠肾上腺皮质功能的影响的最佳用药时间、用药周期及剂量尚需进一步研究。

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本文第一作者简介：

揭凤英(1978-)，女，汉族，硕士，主治医师，主要从事各种中毒及急症的诊疗工作