牛支原体与附红细胞体混合感染病例的实验室诊断

赵 超， 郭小江， 冯孝傲， 成虹松， 罗小芬， 张峻杰， 程振涛，2*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；3. 贵州省草地技术试验推广站，贵州 贵阳 550025)

近年来贵州省养牛产业发展迅速，养殖规模不断扩大，与此同时频繁引种也带来某些疫病的流行和感染，其中因长途运输应激反应引起的呼吸道疾病和虫媒传染病较为多见。2021年11月24日，贵州省铜仁市某养牛场牛群出现以呼吸道症状为主要特征的疫病，临床表现精神沉郁、结膜黄疸、可视黏膜苍白、体温升高、严重贫血、四肢无力、消瘦等。为确诊病因，采集病牛的鼻拭子和耳静脉血作为检测病料进行实验室检测诊断。

1 材料与方法

1.1 检测病料无菌操作采集养殖场发病牛的鼻拭子和耳静脉血各6份(分别编号1～6)。取新鲜血液制备血推片，自然干燥。剩余血液和鼻拭子样品-20 ℃保存备用。

1.2 主要试剂柱式DNA提取试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker(均购自天根生物公司)、姬姆萨染液(购自北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 主要仪器PCR自动扩增仪(型号：TC-412，购自杭州朗基科学仪器有限公司)、凝胶成像系统(型号：SH-510，购自申花科技有限公司)、光学显微镜(购自上海缔伦光学仪器有限公司)。

1.4 引物设计与合成根据GenBank牛支原体标准株PG45的TU基因(登录号：HG520999.1)、牛附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号：AY946266)，分别设计2对特异引物。引物序列分别为：牛支原体-P1：5’-TACGGAAGTAGAATTGTGG-3’；牛支原体-P2：5’-GCAAAACTAGATTTTGAC-3’(预扩增片段1 009 bp)。附红细胞体-F：5’-GATGGAGATCGCC TCCCTAG-3’；附红细胞体-R：5’-GCACCACCTG TCTTACTGATT-3’(预扩增片段412 bp)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 牛支原体核酸检测加入适量生理盐水于鼻拭子离心管中，漩涡震荡均匀，8 000 r/min离心取上清液，采用柱式DNA提取试剂盒提取总DNA，以此为模板对目的基因进行PCR扩增。PCR扩增体系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 pmol/μL) 各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。

1.6 附红细胞体16S rRNA核酸检测将牛耳静脉血反复冻融3次，8 000 r/min离心取上清液。采用柱式DNA提取试剂盒提取总DNA，以此为模板对目的基因进行PCR扩增。PCR扩增体系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 pmol/μL) 各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性55 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。

1.7 血液检查6份血推片用甲醇固定，姬姆萨染色2 h，干燥后置于光学显微镜(10×100倍)下观察。

2 结果

2.1 牛支原体核酸检测结果由图1可见：检测样品中1、3、5号样品扩增出1 009 bp目的条带，提示样品中存在牛支原体感染。

M：2 000 bp分子质量标准； 1～6：检测样品； +：阳性对照； -：阴性对照图1 牛支原体PCR检测

2.2 附红细胞体核酸检测结果由图2可见：检测样品中1、3号样品扩增出412 bp目的条带，提示样品中存在附红细胞体感染。

M：2 000 bp分子质量标准； 1～6：检测样品； +：阳性对照； -：阴性对照图2 附红细胞体PCR检测

2.3 血液检查结果由图3可见：2份血样镜检可见红细胞呈星芒状，与附红细胞体感染特征相符，提示样品中存在附红细胞体感染。

图3 血推片镜检(10×100)

3 结论

通过实验室进行牛支原体核酸检测、附红细胞体核酸检测和血液检查，诊断该场病牛存在牛支原体与附红细胞体混合感染。

4 讨论

4.1牛支原体感染可引起以坏死性肺炎为主要特征的牛呼吸道疾病[1]，多发生于秋、冬季节。附红细胞体是寄生于动物红细胞表面、血浆及骨髓中的病原微生物，可感染人和多种家畜，引起溶血性黄疸和贫血，导致生产力下降，病牛表现为呼吸急促、消瘦、被毛无光泽、可视黏膜苍白或黄疸[2～4]。近年来，牛(包括猪、羊)支原体和附红细胞体混合感染时有发生，发病初期常呈隐性经过，随着病情的发展表现出明显的临床症状[5]。该场发病牛存在明显的呼吸道疾病症状和附红细胞体感染症状，因此为尽快确诊病原，采用分子生物学方法和显微镜直接观察方法对上述病原进行针对性检测。

4.2目前防控这2种疫病主要通过做好环境卫生消毒工作，杀灭蚊、蝇、蜱、鼠类等传播媒介。不同种类动物严禁混养，实施全进全出的饲养模式。感染病例可使用氟苯尼考注射液0.3 mL/kg体重肌肉注射，每天1次，3天为1个疗程。