尤瑞克林对急性脑梗死大鼠保护作用及机制研究

马 宁， 杨永利， 张双鹤， 丁 亮， 闫思蒙

1.北部战区总医院 干一科，辽宁 沈阳110016；2.沈阳医学院，辽宁 沈阳110000

脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，病死率和致残率极高。 其中，急性缺血性脑卒中较为常见，约占脑卒中总数的80%[1]，其发生与高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、吸烟、肥胖和血脂异常等有关[2-3]。 急性缺血性脑卒中的治疗主要包括超急性期的恢复灌注治疗、抗血小板和卒中单元治疗，尚缺少其他有循证医学证据支持的治疗手段[4]。 急性缺血性脑卒中的神经保护治疗一直是国际研究的热点。 然而，动物研究中证实有效的神经保护药物尚未成功转化到临床应用中。 尤瑞克林(Ureklin，HUK)是国家Ⅰ类新药，广泛应用于急性脑梗死的治疗。 HUK 可以增加缺血后内源性组织激肽释放酶表达，有效地促进局部血管再生，有助于急性脑梗死伴3 级高血压或心房颤动的恢复[5]。 有研究表明，HUK 可以激活激肽释放酶-激肽系统，诱导缺血脑组织释放一氧化氮，松弛血管平滑肌，使缺血区血管扩张，改善半暗带脑供血，恢复神经功能缺损[6]。 此外，HUK 还可以通过增加缺血半暗带局部脑血流量，诱导梗死周围的内源性神经干细胞增殖，促进血管和神经再生，开放侧支循环，显著减少大鼠脑缺血再灌注后24 h 脑梗死面积和神经缺损[7]。 本研究旨在探讨HUK 对大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的保护作用机制。 现报道如下。

1 材料方法

1.1 实验动物与分组 30 只雄性健康SD 大鼠，6 周龄，体质量280 ~300 g，购自本溪长生生物科技有限公司。 将大鼠随机分为假手术组(Sham 组)、MCAO 组和动脉泵入HUK 组(HUK 组)，每组各10 只。MCAO 组:建立永久性MCAO 大鼠模型。HUK 组:永久性MCAO 大鼠模型建立后30 min，经动 脉 泵 入 HUK ( 15.625 × 10-4PNAU/kg)。Sham 组:线栓浅插入，不堵塞大脑中动脉，其余手术步骤与MCAO 组相同。 每笼饲养5 只大鼠，在标准饲养条件下(室温20℃±2℃，12 h 明暗周期)自由获取食物和水。 本研究按医院动物实验委员会制定的伦理规定进行。

1.2 MCAO 模型建立 操作过程参考文献[8]。将麻醉后的大鼠仰卧位固定，沿颈前正中线作长约2.5 cm 切口，钝性剥离皮下组织，显露胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌；沿胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌之间的间隙向下剥离，显露颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉；分离颈内动脉、颈总动脉，注意避免损伤迷走神经；分离颈外动脉及其分支枕动脉和甲状腺上动脉，结扎分支动脉，并进一步向远心端分离颈外动脉；动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉。 在颈外动脉远端结扎并切断颈外动脉，然后反折颈外动脉，使其残端与颈内动脉成一直线，由颈外动脉残端插入线栓/微管装置(PE-0402 管)；颈外动脉残端系6-0 脉血液流出，栓/微管装置，然后松开夹闭颈内动脉和颈总动脉的动脉夹；沿颈内动脉推送丝线，小心避免线栓/微管装置进入翼腭动脉；线栓插入距离颈总动脉分叉处约17 ~19 mm，遇到阻力时停止插入；经颅激光多普勒血流仪显示血流值下降至基线值30%以下，MCAO 造模成功。 系紧环绕颈外的动脉丝线，缝合颈前皮肤，75%乙醇擦洗伤口。

1.3 神经功能缺损评分 建模后24 h，由两名不知分组情况的研究人员观察大鼠的症状。 采用改良的Longa 神经功能缺损评分标准对大鼠神经功能进行评分:0 分，无缺陷；1 分，对侧前肢不能完全伸展；2 分，对侧前肢不能伸出；3 分，轻微的向对侧转圈；4 分，严重的向对侧转圈；5 分，向对侧倾倒。

1.4 梗死体积测定 建模24 h 后，经腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠。 将麻醉后的大鼠置于冰盘上，快速断头取脑，取出后立即放入冰箱中冷冻20 min。 然后切去嗅脑、额极、小脑和部分脑干。 用大鼠脑切片模具将剩余部分从前往后切成2 mm厚的脑片，共5 片。 将脑片移入装有4% TTC染液的培养皿中，然后置于37℃恒温箱避光染色20 min，每5 min 晃动、翻面一次，保证脑片着色均匀。 染色结束后，将脑片放入PBS 溶液中洗涤，然后转移至4%多聚甲醛溶液中固定24 h；脑片固定完毕后取出，数码相机照相，使用Image J 图像分析软件计算梗死区域(染色减弱的大脑中动脉供血区域)面积。

梗死体积＝(梗死对侧体积－梗死侧非梗死区体积)/梗死对侧体积×100%

1.5 组织病理学观察 取大脑后，将海马区组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成3 ~5 μm 厚的切片。 脱蜡复水后，用苏木精、伊红染色。 显微镜(OLYMPUS，Japan)下观察组织病理学变化。

1.6 Western blot 使用BCA 蛋白分析试剂盒(Thermo Fisher Science，USA)测定蛋白质浓度，上清液在蛋白SDS-PAGE 负载缓冲液中煮沸。 等量的蛋白质样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离。 然后，将蛋白转移至PVDF 膜(Abcam，UK)上，含有10%脱脂奶粉的封闭液(Solarbio，China)封闭膜1.0 h，用Tris 缓冲盐水加吐温-20(Tween-20，T1082)清洗3 次后，添加相应的一抗(S-100β、NSE、SREBP2、ADMA、DDAH1)，4℃下孵育过夜。 TBST 清洗膜3 次，与HRP 连接的二抗在室温下孵育1.5 h，样品用TBST 洗涤3 次后，增强化学发光法检测，Image J 软件对靶蛋白进行定量分析。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计学软件对数据进行处理。 计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。 以P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 MCAO 组大鼠神经功能缺损评分明显高于Sham 组与HUK 组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见图1。

2.2 各组大鼠大脑梗死体积比较 与Sham 组比较，MCAO 组大鼠大脑可见多处梗死灶(呈白色)，未梗死部分呈红色，而HUK 组大鼠梗死部分较MCAO 组明显减少(图2)。 体积测量发现，MCAO 组大鼠梗死体积为(40.25% ±2.14%)，高于HUK 组的(28.35% ±2.86%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

图2 TTC 染色结果

2.3 各组大鼠大脑组织病理学改变结果 MCAO 组大鼠海马神经元表现为严重的损伤，核变形、细胞肿胀、排列分散，并有典型的细胞凋亡改变。 HUK组神经元损伤明显逆转，表现为海马神经元完整紧密排列，核仁清晰，染色均匀，细胞质透明。 见图3。

2.4 各组大鼠神经损伤标志物水平比较 MCAO 组大鼠大脑组织神经损伤标志物S-100β 和NSE 蛋白表达高于Sham 组与HUK 组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见图4。

图3 HE 染色结果(a.Sham 组；b.MCAO 组；c.HUK 组；HE×200)

图4 各组大鼠神经损伤标志物水平比较

2.5 HUK对MCAO大鼠SREBP2/ DDAH1/ ADMA信号通路影响 MCAO 组大鼠大脑组织ADMA 蛋白表达高于HUK 组与Sham 组，SREBP2、DDAH1蛋白表达低于HUK 组与Sham 组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见图5。

图5 SREBP2、DDAH1、ADMA 蛋白检测结果

3 讨论

HUK 广泛应用于急性脑梗死的治疗，其主要成分是从人体新鲜尿液中提取的238 个氨基酸的糖蛋白，可将激肽原转化为激肽，有选择地扩张大脑小动脉，发挥血管扩张剂的作用，同时可以促进新血管的生成[9]。 然而，HUK 对急性脑梗死的保护作用机制尚不清楚。

ADMA 是内源性一氧化氮合酶的抑制剂，可以减少一氧化氮的生成，导致血管内皮损伤[10]。 内源性一氧化氮可以介导炎症细胞凋亡，调节炎症反应方向，还可以舒张血管及支气管平滑肌，改善通气血流比例[11]。 ADMA 在多种组织和疾病中发挥重要作用，可导致内皮功能紊乱，与高血压、糖尿病、心力衰竭和肺动脉高压的发生密切相关[12-13]。本研究发现，MCAO 组大鼠神经功能缺损评分增加，大脑梗死体积增加，大脑组织ADMA 表达显著增加，而HUK 明显降低了ADMA 表达，提示ADMA可能在脑梗死过程中发挥重要作用。

本研究中，MCAO 组大鼠DDAH1 蛋白表达降低，而HUK 可以明显增加MCAO 大鼠DDAH1 蛋白表达。 DDAH1 是ADMA 的主要水解酶，可以将ADMA 分解为瓜氨酸和二甲胺经肾排出[15]。DDAH1 与动脉粥样硬化、高血压、慢性心功能不全、高脂血症、糖尿病及周围动脉闭塞性疾病有关[16-17]。 DDAH1 还可以通过激活Ras/PI3K/Akt通路，提高体内一氧化氮水平[18]。 SREBP2 是内质网驻留的转录因子，通过细胞内胆固醇的减少和内质网钙离子的丢失被激活，然后诱导触发核转位和胆固醇调节基因[19]。 有研究发现，辛伐他汀可以促进SREBP2 蛋白表达，从而促进DDAH1 转录，降低 ADMA 表 达[20]。 这 提 示， HUK 可 能 通 过SREBP2/DDAH1/ADMA 信号通路发挥对大鼠急性脑梗死的功能保护作用。

综上所述，HUK 可明显改善MCAO 大鼠神经功能缺损评分，减轻大脑梗死体积，缓解神经元损伤，降低S-100β 和NSE 蛋白表达，对急性脑梗死发挥保护作用，这种保护作用可能通过调节SREBP2/DDAH1/ADMA 信号通路实现。