跨膜蛋白16A 通过激活AKT1 信号通路对卵巢癌SKOV3 细胞增殖、侵袭影响

王 列， 申 健， 高 璐， 仲 莞， 李思思， 白 莹，

张文竹北部战区总医院 妇产科，辽宁 沈阳 110000

卵巢癌是严重威胁女性健康的一种恶性肿瘤，病死率较高[1-2]。 传统的卵巢癌治疗手段包括手术、化疗及中西药干预。 近年来，靶向治疗成为临床研究热点，寻找新的卵巢癌生物分子标记物及深入探讨其病因和发病机制具有重要意义。 钙激活氯通道跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)在多种肿瘤中高表达并参与肿瘤的发生发展，但有关TMEM16A 如何促进卵巢癌细胞增殖和侵袭的分子机制，目前尚不清楚[3]。 本研究对癌症基因组图谱(THE CANCER GENOME ATLAS，TCGA)数据库中卵巢癌患者的临床数据和基因表达谱进行统计分析，探讨TMEM16A 高低表达对卵巢癌患者生存期的影响，以及TMEM16A 促进卵巢癌细胞增殖侵袭的作用通路，为卵巢癌靶向治疗提供理论基础和研究数据。 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人卵巢癌SKOV3 细胞购于美国模式培养物集存库。 TMEM16A 抗体(英国Abcam生物技术公司)；抗总AKT1 和磷酸化AKT1(p-AKT1，Ser473)抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司；辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔二抗(英国Abcam 生物技术公司)；L-15 培养基(美国Gbico公司)；胎牛血清(美国Gbico 公司)；胰酶(美国Hyclone 公司)；Perifosine(Akt1 抑制剂)购自上海MCE 公司；RIPA 缓冲液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(中国Beyotime Biotechnology 公司)；CCK-8 试剂盒(中国Biosharp 公司)；Lipofectamin 2000(美国Invitrogen 公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 TCGA 数据收集 从TCGA 网站(http:/ /cancergenome.nih.gov/)下载卵巢癌患者的临床数据和转录组数据。 临床数据包括患者信息、肿瘤大小和存活时间等。 转录组数据包括患者编号、基因名称和表达数值。 本研究按照TMEM16A 和AKT1 基因表达的中位值将患者分为高表达组与低表达组，统计病灶>2 cm 的52 例卵巢癌患者的总生存曲线。

1.2.2 细胞培养 SKOV3 卵巢癌细胞解冻复苏后接种于含有10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的L-15 培养液中，置入37℃、5% CO2的恒温孵育箱中。 细胞传代冻存采用胰酶消化并继续培养备用。

1.2.3 转染 TMEM16A 的过表达质粒购于上海吉凯基因公司。 采用Lipofectamin 2000 在SKOV3细胞中使用无血清的培养基瞬时转染的TMEM16A的过表达质粒。 48 h 后用于后续实验。

1.2.4 Western blot 将转染后的卵巢癌SKOV3细胞置于冰上，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA 缓冲液进行匀浆。 将细胞裂解物以13 000 r/min 离心20 min，使用BCA 方法测定蛋白质浓度。 目标蛋白通过SDS-PAGE 分离，待蛋白转印到PVDF 膜上后用5%的脱脂牛奶封闭2 h，经洗涤液清洗3 次，每次25 min 后，使用TMEM16A(1 ∶2 000)，AKT1(1∶2 000)和p-AKT1(1∶2 000)一抗孵育，4℃过夜。漂洗后将膜与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔二抗(1∶10 000)室温下孵育1 h。 使用伯乐化学发光检测系统对条带进行ECL 化学发光试剂检测。

1.2.5 CCK-8 实验 将转染TMEM16A 的SKOV3细胞(5 ×103个/孔)种植到96 孔板，24 h 后换成无血清培养，应用10 μmol/L Perifosine(AKT1 抑制剂)刺激细胞24 h 后，每孔加入CCK-8 溶液37℃一同温育2 h。 采用酶标仪在450 nm 波长下测量吸光度值(optical density，OD)。

1.2.6 Transwell 细胞体外侵袭实验 将转染TMEM16A 的SKOV3 细胞150 μl(4 ×105个/ml)细胞悬液添加到已加入基质胶的Transwell 小室上室中，下室加入含有20% 胎牛血清的培养基，放入37℃、5% CO2的培养箱培养24 h。 24 h 后用4%多聚甲醛固定20 min，Giemsa 染液染色35 min，磷酸盐缓(phosphate-buffered saline，PBS)清洗3 次，弃PBS 后于显微镜下随机视野进行拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计学软件对数据进行处理。 计量资料用均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。 计数资料用例(百分率)表示，组间比较采用χ2检验。 采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，并采用Log-rank 检验进行分析。 以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMEM16A、AKT1 基因高低表达的卵巢癌患者的生存期比较 统计TCGA 数据集中52 例卵巢癌患者的基因和临床数据显示，TMEM16A 基因高表达26 例，中位生存期(median survival，MS)为31.63 个月；TMEM16A 基因低表达26 例，MS 为54.00 个月；两组比较，差异有统计学意义[风险比＝2.14(95%可信区间:1.09 ~4.36)，P <0.05]。AKT1 基因高表达26 例，MS 为40.43 个月；AKT1基因低表达26 例，MS 为73.93 个月；两组比较，差异有统计学意义[风险比＝0.55(95%可信区间:0.25 ~1.19)，P<0.05]。 TMEM16A/AKT1 联合高表达15 例，MS 为31.63 个月；TMEM16A/AKT1 联合低表达15 例，MS 为58.20 个月；两组比较，差异有统计学意义[风险比＝2.67(95% 可信区间:1.16 ~7.50)，P < 0.05]。 提示TMEM16A/AKT1高表达的卵巢癌患者预后差，生存期显著下降。见图1。

图1 卵巢癌患者中TMEM16A 与AKT1 基因表达的生存曲线图(a.TMEM16A 基因高低表达患者生存曲线；b.AKT1 基因高低表达患者生存曲线；c.TMEM16A/AKT1 联合高低表达患者生存曲线)

2.2 TMEM16A 对卵巢癌SKOV3 细胞中AKT1 蛋白表达的影响 转染空质粒与过表达TMEM16A 的卵巢癌SKOV3 细胞中TMEM16A 蛋白表达分别为(0.59 ±0.05)、(0.98 ±0.08)，p-AKT1 蛋白表达分别为(0.54 ±0.03)、(1.10 ±0.08)，AKT1 蛋白表达分别为(1.21 ±0.13)、(1.20 ±0.09)。 转染空质粒与过表达TMEM16A 的卵巢癌SKOV3 细胞中TMEM16A 和p-AKT1 蛋白的表达情况比较，差异均有统计学意义(P <0.05)。 提示TMEM16A 高表达能够激活卵巢癌细胞内AKT1 信号通路。 见图2。

图2 TMEM16A 对卵巢癌SKOV3 细胞中AKT1 蛋白表达的影响

2.3 TMEM16A 对SKOV3 卵巢癌细胞增殖的影响 CCK-8实验结果显示，TMEM16A 过表达能够增强SKOV3 细胞的增殖能力，相对于转染空质粒对照组的(100.00% ±0)，TMEM16A 过表达的增殖力为(139.20% ±7.36%)，TMEM16A 过表达＋Perifosine 的 增 殖 力 为(68.82% ± 7.80%)， 提 示TMEM16A 的促增殖作用可以被AKT1 抑制剂Perifosine 所逆转，TMEM16A 通过AKT1 信号通路促进SKOV3 细胞增殖。 见图3。

图3 转染TMEM16A 及应用AKT1 抑制剂后对SKOV3 卵巢癌细胞增殖的影响(与转染空质粒对照组比较，①P<0.01；与转染过表达TMEM16A 比较，②P <0.001)

2.4 TMEM16A 对SKOV3 卵巢癌细胞侵袭的影响 在卵巢癌SKOV3 细胞中，过表达TMEM16A 后侵袭能力增强，而在过表达TMEM16A 细胞中加入AKT1 抑制剂Perifosine 后其侵袭能力下降，提示TMEM16A 高表达促进SKOV3 细胞侵袭，AKT1 抑制剂可限制TMEM16A 高表达的侵袭能力。 见图4。

3 讨论

TMEM16A 又称Anoctamin1，被证实为钙激活氯通道，在包括头颈癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌在内的多种肿瘤中高表达，参与调节细胞增生、迁移等生物学行为[4-7]。 目前，TMEM16A 对肿瘤细胞转移的影响方面的相关研究报道较少。深入研究TMEM16A 在肿瘤中的功能及作用机制具有一定的科研意义。

图4 转染TMEM16A 及应用AKT1 抑制剂对SKOV3 卵巢癌细胞侵袭的影响(200 倍)

TMEM16A 高表达对不同肿瘤细胞增生、迁移、侵袭等生物学行为的作用不同。 大量研究报道，TMEM16A 高表达促进包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌、头颈癌、结直肠癌等多种肿瘤细胞增生以及在体肿瘤生长[8-13]。 然而，也有研究报道，TMEM16A高表达抑制肿瘤细胞及非肿瘤细胞(如肺内皮细胞)的增生[6]。 本研究结果发现，在TCGA 中，TMEM16A 高表达与低表达TMEM16A 的卵巢癌患者比较，高表达TMEM16A 患者的存活率显著降低，提示TMEM16A 在卵巢癌的发生发展中发挥重要作用，可能成为卵巢癌治疗的潜在靶向生物标记物。因此，进一步研究TMEM16A 钙激活氯通道在卵巢癌转移过程中的作用原因是深入了解其参与卵巢癌发生发展的前提。

肿瘤细胞的增殖和迁移与其胞内信号通路的活化密切相关，但TMEM16A 高表达的卵巢癌细胞开启的信号通路种类目前尚不清楚。 2013 年，Britschgi 等[14]研究发现，敲除TMEM16A 可通过下调乳腺癌细胞中AKT 磷酸化蛋白的表达抑制增殖。AKT 是细胞内特异性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，AKT 的活化调控许多细胞的生理病理过程[15-17]。本研究进一步通过对TCGA 数据库中卵巢癌患者信息分析发现，AKT1 基因高表达组总存活率低于低表达组，TMEM16A/AKT1 联合高表达组的总存活率明显低于TMEM16A/AKT1 联合低表达组。AKT 信号通路在卵巢癌的发展进程中发挥重要的调控作用，例如肿瘤细胞的生长、侵袭、转移、凋亡及自噬等生物学行为[18-19]。 因此，探讨TMEM16A的表达是否影响AKT1 蛋白水平对于卵巢癌预防、诊断和预后判断具有临床意义。

AKT 基因的异常活化可使肿瘤细胞逃避凋亡，异常增殖分化，促进肿瘤血管生成和肿瘤的发生[20-21]。 本研究发现，在过表达TMEM16A 的SKOV3 卵 巢 癌 细 胞 中， p-AKT1 显 著 增 加， 转 染TMEM16A 的SKOV3 卵巢癌细胞增殖能力增强，而应用AKT1 抑制剂处理后能下调TMEM16A 高表达引起的增殖情况，说明TMEM16A 对卵巢癌细胞增殖能力的调控是通过对AKT1 基因的调节完成的。Transwell 实验结果显示，高表达TMEM16A 的卵巢癌细胞侵袭能力增强，加入AKT1 抑制剂后可影响TMEM16A 高表达的侵袭能力，提示靶向干预TMEM16A 表达可对卵巢癌的转移具有一定的抑制作用。

综上所述，过表达TMEM16A 可以激活卵巢癌SKOV3 细胞中AKT1 蛋白。 TMEM16A 可能通过激活AKT1 促进卵巢癌SKOV3 细胞增殖和侵袭。 本研究为TMEM16A 靶向性的标记、参与卵巢癌的治疗及预后提供了新的理论依据。