基于慢性轻度不可预知性温和型应激的C57BL/6N小鼠抑郁模型的建立与评价

约日古丽·麦海提 任小巧 范佳佳 李 鑫 刘媛媛 毛 萌

(北京中医药大学，北京，100029)

抑郁症是由各种因素引起的一种心境障碍或情感障碍性疾病[1]，其主要临床表现为情绪低落、对外界兴趣减退、感到内疚、毫无价值感及反复出现自杀念头、食欲和体质量显著变化(增加或减少)、睡眠紊乱(嗜睡或失眠)等，除此之外它还可能会影响心血管系统、免疫系统及神经系统等，从而对人类生命健康产生威胁[2-3]。该病致残率及发病率高，女性更易遭遇抑郁症[4-5]。目前全球抑郁症患者大约3.4亿人，其中15%～20%的患者最终自杀身亡[6]。2030年抑郁症可能会成为全球最大的健康杀手[4,7]，尽管如此，至今关于抑郁症病因病机的探索尚处于初级阶段[8]，更为棘手的是本病具有异质性，临床症状不一致，表现形式多样、相关症状繁多，因而目前研究尚无法解释抑郁症的所有方面[9-10]。

抑郁动物模型是研究抑郁症必不可少的工具，广泛应用于抑郁症病因病机研究及抗抑郁药的筛选。众所周知，社会环境因素是抑郁症发病的重要危险因素，以环境压力为背景的抑郁动物模型的研究较为关键。慢性轻度不可预知性温和型应激(Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS)模型是一种强有效的抑郁动物模型，通过各种环境物理刺激方法，在动物不可预知的情况下长期施加于实验动物，能有效模仿人类日常生活中遇到的各种心理压力。本研究选取无特定病原体(Specific pathogen Free，SPF)级C57BL/6N小鼠，通过CUMS法，连续8周进行持续性刺激，建立CUMS应激抑郁模型，探索CUMS法建立抑郁症C57BL/6N小鼠模型的条件，在此基础上观察不同时间点该模型行为学变化，以明确造模时间对动物模型的影响，对该模型进行评价和优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 7周龄SPF级C57BL/6N雄性小鼠，体质量18.0～21.0 g，实验单位使用许可证编号：SYXK(京)2016-0038(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)。实验动物饲养于清洁级动物房，室温维持在(25±1)℃，湿度维持在(65±5)%，采用12 h循环交替光照法(光照时间为7:30到19:30)昼夜节律。实验前适应性喂养1周。

1.1.2 仪器 1)小鼠旷场行为测试箱：长×宽×高为50 cm×50 cm×40 cm的木制箱。底面用黑线划分成面积相等的25个正方形方格，每行和每列各5个方格，中心9格为中央区。旷场箱中央正上方安置摄像头，观察记录小鼠活动情况。2)小鼠游泳池：高度为30 cm，直径为20 cm的圆柱形游泳池。3)小鼠悬尾箱：地面高度20 cm的纸箱，一面敞开，其余各面封闭。4)小动物生理系统检测仪(Harvard Apparatus，美国，型号：HPMS)。5)行为学记录分析软件：EthoVision XT.15影像跟踪系统(诺达思信息技术公司，荷兰，型号：EthoVision XT.15)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将动物适应性饲养1周后，先对所有小鼠进行旷场实验，按旷场实验评分淘汰个别自发运动差的小鼠，再将纳入的56只小鼠按体质量随机分为对照组(n=14)和CUMS抑郁模型组(n=42)。对照组每5只一笼，正常饲养；CUMS组单笼饲养，给予CUMS应激，其干预内容如下：倾斜(45°)12 h、湿垫料(笼里加250 mL左右的水)过夜、束缚6 h、禁饮24 h、禁食24 h、冷水浴(4 ℃)3 min、热水浴(45 ℃)3 min、昼夜交替8 h、频闪8 h、空瓶刺激24 h、夹尾(尾尖1 cm处)2 min、陌生异常物品刺激(如塑料杯、牙刷等)过夜、合笼(2只小鼠一笼)过夜、冷环境2 h、长夜12 h、长昼24 h、大鼠垫料24 h等诱导抑郁症的形成，每天给予23种应激，同一种应激1周内不得出现2次以上，共执行8周。

1.2.2 检测指标与方法

1.2.2.1 一般情况的观察 每天观察所有小鼠的一般情况，包括毛发色泽、活跃程度、精神状态、身体姿态、抓取时挣扎反映程度、对应激的反应情况及大小便等。

1.2.2.2 小鼠体质量和肛温的检测 造模前、造模第1、2、3、4、5、6、7、8周末分别对2组小鼠进行称重，并记录不同时点的小鼠体质量变化。造模第3、5、8周末分别对2组小鼠进行肛温检测，检测肛温时将小动物生理检测器的探头插入小鼠肛门内，深度以探头完全进入肛门为标准，维持时间至少10 s。

1.2.2.3 糖水偏好实验 糖水偏好实验(Sucrose Preference Test，SPT)用于测量小鼠快感缺乏，小鼠糖水偏好率下降显示小鼠快感缺乏[11]。造模前3 d，训练动物适应糖水测试，将所有小鼠单笼饲养，每笼同时放置2个水瓶。第1天，两瓶均装1%蔗糖水；第2天放置蔗糖水和蒸馏水各1瓶，每4小时转换水瓶的位置，以防小鼠对水瓶的位置产生偏好；第3天禁食禁水；第4天上午9点，每只小鼠同时给予事先定量好的蔗糖水和蒸馏水各1瓶，2 h后取走所有水瓶并称重。造模开始后按上述实验方法分别在造模第3、5、8周末做一次SPT，并计算糖水偏好率(1%糖水消耗量/总水消耗量×100%)。

1.2.2.4 旷场实验 旷场实验(Open Field Test，OFT)可检测小鼠自发运动能力以及探索行为，效果显著、操作方便，对小鼠的伤害小[12]。本实验造模前，造模第3、5、8周末各做1次OFT，实验开始前将小鼠置于实验室60 min让其适应实验室环境，观察时将单只小鼠置于50 cm×50 cm×40 cm光洁敞箱中央(箱内表面颜色为蓝色、地板为白色)，由摄像机记录小鼠5 min内的动作行为表现，并由1名实验人员在固定位置记录小鼠直立次数(小鼠前两肢完全离开底板或爬墙)、修饰行为(理毛)情况，在每次测试完成之后，用75%的乙醇进行清理。整体实验结束后通过EthovisionXT.15软件分析旷场视频。

1.2.2.5 强迫游泳实验 强迫游泳实验(Forced Swimming Test，FST)是由Porsolt于1978年开发的一种啮齿动物行为实验，常用于评估模型动物抑郁样行为，具有良好的可信度和预测效度[13-14]。本实验造模前，造模第3、5、8周末各做1次强迫游泳实验。将小鼠放入高30 cm，直径20 cm的圆柱形游泳池，水位15 cm，水温23～25 ℃，将小鼠放置在水中6 min，前2 min让其适应环境后，记录后4 min中内不动的时间，当小鼠以直立的姿势漂浮，只做一些小动作把头露出水面时才被判断为不动[15]。每次测完后换水，实验过程中保持实验室环境安静。

1.2.2.6 悬尾实验 悬尾实验(Tail Suspension Test，TST)从1985年首次引入抑郁症研究领域以来已有20余年，一直被用于抗抑郁药的筛选以及动物模型行为评价[16]。实验全过程通常持续6 min，TST不动时间一般被评价为小鼠绝望状态[17]。本实验造模前，造模第3、5、8周末各做1次悬尾实验。自制离地面高度20 cm的纸箱，纸箱一面敞开，便于观察小鼠，其余各面封闭，避免外界环境的干扰，从其中一个侧面穿一小圆孔，将小鼠尾巴从圆孔穿过去，一位实验员抓小鼠尾根1/3处保持不动，另一位实验员记录小鼠不动的时间。前2 min让小鼠适应环境，后4 min记录不动时间，实验过程中保持实验室环境安静。

2 结果

2.1 对小鼠一般情况的影响 造模开始之前对照组和CUMS组小鼠均毛发整洁光亮，活泼好动，精神状态良好。应激3周后抓取CUMS组小鼠时，小鼠反应不太剧烈，易抓取，喜欢叠摞垫料在角落里睡觉，而对照组小鼠抓取时不易抓取，多动，抓取后用四肢反抗，喜欢趴在笼盖上。应激5周后，CUMS组小鼠毛发凌乱、枯黄失泽，抓取时容易脱毛，对冰水浴、热水浴刺激的耐受能力下降(耐受时间<3 min)，合笼时相互殴斗不太剧烈，抓尾巴时反应迟钝，抓颈部皮肤时不反抗，平时嗜睡、蜷卧在笼角落里。对照组小鼠依然活泼好动，毛发光泽，未出现脱毛等现象。第7周后CUMS组小鼠后颈、背、头等身体各部分毛发出现片状脱落，精神萎靡、体型瘦削。见图1。

图1 毛发变化

2.2 体质量变化 造模开始之前2组小鼠体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模开始之后，前3周对照组和CUMS组小鼠体质量均有不同程度的增长，2组之间差异无统计学意义(P>0.05)。至造模第4周后，CUMS组小鼠体质量呈下降趋势，2组体质量差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2 体质量变化

2.3 肛温的变化 与对照组比较，CUMS组在造模第3、5、8周肛温差异均无统计学意义(均P>0.05)，可认为造模过程中或造模建立后CUMS组小鼠体温未出现显著变化，体温正常。见图3。

图3 2组小鼠肛温比较

2.4 对行为学变化的影响

2.4.1 糖水偏好实验 分别在造模第3、5、8周末对所有小鼠进行糖水偏好实验，计算2组小鼠糖水偏好百分比，并且这3个时间点CUMS组糖水偏好率显著低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，可认为此时间点CUMS组小鼠糖水摄入量均低于对照组。见图4。

图4 糖水偏好实验

2.4.2 旷场实验 本研究重点观察了2组小鼠在造模第3、5、8周后的OFT抑郁样行为。其中造模第3、5周后，2组小鼠的OFT行为表现结果比较差异均无统计学意义(均P>0.05)；第8周后结果显示，CUMS组小鼠水平运动总距离及运动速度均显著小于对照组(均P<0.05)。见图5～6。并且其中央区运动累积时间显著少于对照组(P<0.05)。见图7～8。垂直运动和修饰行为比较，CUMS组小鼠出现了垂直运动次数的减少而修饰行为的增多，2组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1～2。

图5 运动速度

图6 运动距离

图7 中央格停留时间

图8 旷场实验轨迹

表1 2组小鼠直立次数比较次)

表2 2组小鼠修饰行为次数的比较次)

2.4.3 悬尾实验 与对照组比较，造模第3、5、8周后，CUMS组小鼠悬尾实验不动时间长，2组差异有统计学意义(P<0.05)。见图9。

图9 悬尾实验

2.4.4 强迫游泳 与对照组比较，造模第3周CUMS组强迫游泳不动的时间长，2组差异有统计学意义(P<0.05)，可认为CUMS组小鼠表现为强迫游泳实验不动时间出现了延长。造模第5、8周2组小鼠强迫游泳实验不动的时间长虽均有延长，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图10。

图10 强迫游泳实验

2.4.5 不同时点CUMS组小鼠抑郁行为比较 对CUMS组小鼠造模3、5、8周时行为学变化进行多重比较：CUMS组小鼠在应激过程中体质量逐渐减轻(P<0.05)；SPT结果比较发现，这3个时间点糖水摄入量差异无统计学意义(P>0.05)；OFT结果显示，CUMS组小鼠直立次数和中央各停留时间逐渐减少(均P<0.05)，修饰行为增多(均P<0.05)，水平运动总距离和运动速度造模8周时出现显著缩短及减慢(P<0.05)；FST不动时间逐渐延长(P<0.05)；TST不动时间至造模第5周有显著延长，造模第8周时开始缩短(P<0.05)。见表3。

表3 CUMS组小鼠各时间段行为学结果比较

3 讨论

C57BL/6(B6)小鼠是生物医学和行为实验研究中使用最广泛的品系，B6小鼠较活跃，学习能力强，且近交系动物品系提高了动物实验的可靠性和重复性[18-19]，故本研究中选择了B6的近交系C57BL/6N小鼠。

当前，抑郁症的造模方法有20余种，目前常用有习得性无助(Learned Helplessness，LH)、慢性不可预知性温和型应激(CUMS)、社会失败应激(Social Defeat Stress，SDS)、生命早期应激(Early Life Stress，ELS)、行为绝望(强迫游泳和小鼠悬尾)、给药(如：糖皮质激素)、基因操作等[20-21]。其中CUMS是目前最常用、最可靠，能有效模仿抑郁症病因病机的啮齿类动物抑郁模型[22]，该模型是20世纪80年代后期发展起来的，至今已有30多年的经历。CUMS模型诱导条件相对真实，通过给予各种不同压力源，以防止或延迟习惯性，较常用的压力源有：昼夜颠倒、社会压力、禁饮、禁食、束缚、湿垫料、强迫游泳和倾斜等[23-24]。不同实验室对CUMS内容及操作也不尽一致，本研究通过倾斜、湿垫料、束缚、禁饮、禁食、冷水浴、热水浴、昼夜交替、频闪、空瓶刺激、夹尾、陌生异物、合笼、冷环境、长夜、长昼、大鼠垫料等刺激对C57BL/6N小鼠进行了连续8周的持续性刺激。

一般情况观察发现小鼠暴露于CUMS应急后逐渐出现活动减少、精神不振、毛发变软、易脱落；造模7周时上述情况更加恶化，甚至出现毛发片状脱落。造模过程中CUMS组小鼠体质量逐渐减轻，具有显著时间-应激交互作用；SPT显示，造模3周时CUMS组小鼠糖水摄入量显著下降，即出现了快感缺失，并且整个应激过程中几乎保持同一水平，可见C57BL/6N小鼠糖水摄入率的变化无显著时间效应。上述变化十分类似于大部分抑郁症患者中出现的体质量逐渐减轻、脱发、愉悦感丧失等临床症状[25-26]。

CUMS应激会逐渐削弱抑郁模型动物主动应对压力的动机，因此CUMS组小鼠在TST和FST不可避免的恶劣环境(水/悬尾)中会出现短时间内适应环境后放弃挣扎而保持不动的行为表现，即“绝望”情感状态，虽然这2种实验理论基础相同，但是他们之间有区别，各品种动物对该实验的敏感度不同[27]，有研究者发现C57BL/6品系在TST过程中有爬尾倾向[28-29]，本研究中C57BL/6N小鼠TST过程中亦出现了类似行为，并且FST中不动时间比TST长。经各时间点分析发现，造模3周时CUMS组小鼠FST和TST不动时间均显著延长；造模5周时TST和FST不动时间比3周时的更长，到8周时虽然2组组间比较CUMS组小鼠TST不动时间有显著延长，但是CUMS组组内比较发现其不动时间呈缩短趋势，说明随着时间的延长C57BL/6N小鼠对TST敏感性降低，产生了适应性。在造模第5、8周时FST中，2组小鼠均出现了不动时间的延长，使得2组差异无统计学意义，这可能与季节更换有关，因为本实验十月中旬开始进行，实验后期时刚好是入冬。有研究表明，强迫游泳实验会受到季节因素的影响，在冬天时老鼠强迫游泳不动时间会增多，而在春天会减少[30]，并且临床上亦有发现，太阳照射时间的缩短，比如秋季，会增加抑郁症发病率[31]，这说明季节因素在抑郁症发病过程中可能有一定的影响。从这2种实验中发现C57BL/6N小鼠较敏感于FST，随着时间的延长该品种小鼠可能会对TST产生耐受。

OFT一般检测抑郁模型动物在新的、陌生环境条件下的自主运动活动及探索行为(直立、爬墙、穿梭中央区)的变化状况[32]。本研究重点分析了C57BL/6N小鼠OFT水平运动总路程、运动速度、箱中央各停留累积时间、直立运动次数、修饰行为频数等5个指标，并发现C57BL/6N小鼠遭受为期5周的CUMS后出现直立次数和中央各停留时间的显著减少，而且其中直立行为随着应激时间的延长会逐渐减少；造模时间延期到第8周时则表现为水平运动总路程减小、运动速度减慢、修饰频繁等。该时间较其他研究晚[33-34]，这可能和应激程序或小鼠品系或品种不同有关。从上述异常的行为表现中得出：C57BL/6N小鼠受到应激后先丧失了对外界的兴趣，即探索能力，并且随着应激时间的延长逐渐加重，而它的自发运动能力当环境压力已超过其承受能力时才出现减弱；而修饰行为是啮齿类动物天生的行为，具有清洁及维护毛发、皮肤的作用，动物理毛时间及理毛次数与环境因素和压力有关，压力源会增加实验动物的理毛次数[35-36]，正如本研究显示，较长时间(8周)的CUMS诱C57BL/6N小鼠修饰行为次数频繁。

经各时间段行为学评价，从上述实验结果分析可得出CUMS组小鼠行为变化具有逐渐性：应激早期(3、5周时)出现快感缺失、绝望感，探索能力逐渐减弱，并且这些前期行为变化较符合于抑郁症患者所出现的对外界事物兴趣丧失、愉快感丧失、疲乏或精力减退、绝望感等轻度临床抑郁表现[37]；到第8周时CUMS组小鼠抑郁表现更为显著，CUMS组小鼠行为学障碍加重，其行为变化和严重抑郁症患者临床上所出现的运动执行能力及社会交际或交往能力下降、探索思考能力减退等行为表象十分相似[38]。

4 小结和展望

综上所述，本研究通过CUMS应激诱导C57BL/6N小鼠建立了抑郁样动物模型，并由此发现该模型中随着造模时间的延长，C57BL/6N小鼠抑郁表现更为显著，抑郁程度逐渐加重：首先出现快感缺失、绝望感、对外界兴趣减退，随着时间的延长会出现运动能力减弱等行为表现。本研究为今后针对抑郁症各阶段的药物研究和对抑郁症各阶段的临床表现及其进程的研究提供了参考，但是还需要进一步结合多项指标进行验证。

本实验研究发现C57BL/6N小鼠对笼内环境很敏感，平常喜欢干燥、干净的环境，如若放在刨花类垫料笼里喜欢在笼角落建筑圆形巢穴，并且喜欢在自建巢穴里睡觉，白天喜欢爬在笼盖栏杆上，但是每次湿笼过夜或束缚后表现为精神萎靡，爬杆或笼里运动减少等，所以适当增加湿笼子和束缚次数，可能会有助于缩短造模时间；此外将来研究抑郁模型动物筑巢方面的行为研究中C57BL/6N小鼠的实验效果可能会较好。

抑郁动物模型的制备，尤其是CUMS模型易受环境因素的影响，不同的实验环境以及CUMS刺激方式会导致不同的实验结果，并且不同品系或品种动物对应激的敏感程度不同，甚至行为学实验(OFT、TST、FST)等表现差异有统计学意义[39]，例如：C57BL/6、BALBC、昆明、ICR等不同品系小鼠旷场行为表现差异有统计学意义[40]，除此之外C57BL/6品系中最常用的C57BL/6j和C57BL/6N之间差异有统计学意义[41]，因此在不同实验室很难得到一致的实验结果。抑郁模型研究不仅注重实验动物生理解剖结构特点，还需要注重其本性情感特点，所以抑郁模型的制备需要将来从动物品系或品种以及性别的选择、造模环境等方面进行进一步细化研究，并且按照动物的行为特点科学地选用合适的动物品系或品种，再选择该实验动物较敏感的刺激方式，从而提高模型效果以及实验结果的一致性。