一测多评法测定不同寄主肉苁蓉中4种苯乙醇苷类含量

冯 洁 郭晔红 姜 侃 朱文娟

(1 甘肃省干旱生境作物学重点实验室，兰州，730070； 2 甘肃农业大学农学院，兰州，730070)

肉苁蓉来源为列当科植物肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)或管花肉苁蓉(Cistanchetubulosa(Schenk)Wight)的干燥带鳞叶的肉质茎，主要功效为补肾养阳、益精益血、润肠通便等[1]，其主要生物活性成分为苯乙醇苷类[2]。现代药理研究表明，肉苁蓉具有增强机体免疫力、助阳排便、保肝、改善大脑记忆等药理作用[3-9]，通常用于经血不足、肾阳虚等多种疾病，是一种有价值的中草药[10]。

肉苁蓉是一种寄生植物，寄主植物通常为藜科梭梭属植物梭梭[Haloxylonammodendron(C.A.Mey.)Bunge]，通常分布在我国西北地区，具有耐旱、耐盐、耐贫瘠等特性[11]，是一种极其重要的防沙固沙植物[12]。肉苁蓉的各种栽培技术都在不断改进[13]，但因梭梭的生长受到限制，生长4年以后才可以培养沙漠肉苁蓉，阻碍了肉苁蓉的生长过程，制约了肉苁蓉产业的发展。近年来，技术人员在甘肃省成功种植了以四翅滨藜[Atriplexcanescens(Pursh)Nutt]为寄主植物的肉苁蓉，极大地促进了肉苁蓉的发展。因为四翅滨藜和梭梭同属藜科植物，关系密切，广泛应用于牧草和盐碱地改良，被称为“生物脱盐器”[14-17]，四翅滨藜生长迅速，具有较强的抗寒、抗盐、抗碱特性。四翅滨藜是垦荒，退化牧场改良，恢复工矿区的废墟地带、道路两旁、盐含量高的荒漠地带植被和水土保持的先锋树种。它的蛋白质含量高，是饲养牛、羊的好饲料。其可饲性、产肉率与其他几种常见的饲料相当。同时四翅滨藜的生物量较大，尤其在冬春雪后不易被雪掩埋，从而可以提高牧区的抗“白灾”能力。建立四翅滨藜的灌木饲料林，对于气候干旱、草场产草量低、牛羊饲草严重不足的地区来说，具有十分重要的意义。

然而，目前国内外对其寄生关系的关键问题，以及寄生在四翅滨藜上的肉苁蓉的质量特性尚不清楚，而肉苁蓉因具有较高的药用价值，具有巨大的市场价值和良好的开发前景。一测多评(Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker，QAMS)是一种新的适合中药特点的多指标质量评价模型，在只测定一种成分的情况下，实现对多种成分含量的同时测定。在中药成分的测定中，由于中药成分复杂，活性成分多，通常需要多种对照品，化学成分难以分离，价格昂贵，导致大量的中药对照品匮乏[18]。QAMS通常只需要测出一种化学成分含量，根据中药化学成分的内在联系和比例，通过一种成分含量得出多指标成分含量，其方法在中药化学成分测定中已经得到了证实。本研究以不同寄主植物肉苁蓉为研究对象，采用一测多评法分析肉苁蓉中松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的含量变化[19-22]，旨在进一步研究不同寄主植物肉苁蓉中4种苯乙醇苷成分的含量变化，为肉苁蓉的开发和利用提供一定的科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(Waters公司，美国，型号：waters Arc)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士，型号：AL104)；超声波清洗器(深圳市得康科技有限公司，型号：KQ-100E)。

1.2 试剂 松果菊苷(批号：82854-37-3)、肉苁蓉苷A(批号：93236-42-1)、毛蕊花糖苷(批号：61276-17-3)，购于成都普菲德生物技术有限公司；管花苷A(上海源叶生物科技有限公司，批号：112516-05-9)；水为超纯水，甲酸、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 分析样品 鲜品肉苁蓉产地为甘肃省白银市民勤县，采收时间为2019年11月，经甘肃农业大学郭晔红副教授鉴定为肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma带鳞叶的肉质茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；洗脱梯度(0～5 min，15%～20% A；5～12 min，20%～45% A；12～16 min，45%～55% A；16～20 min，55%～35% A；20～22 min，35%～15% A；22～24 min，15% A)；流速为1.0 mL/min；检测波长为330 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。色谱图见图1。

图1 HPLC色谱

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的对照品适量，加入50%甲醇，制成每1 mL含松果菊苷0.59 mg、肉苁蓉苷A 0.14 mg、管花苷A 0.015 mg和毛蕊花糖苷0.027 mg的混合对照品溶液，4 ℃冰箱保存。

2.3 供试品溶液的制备 取肉苁蓉样品1.0 g，置于锥形瓶中，加50 mL的50%甲醇，称重，浸泡30 min，超声处理40 min(功率250 W，频率35 kHz)，冷却至室温，加50%甲醇补重，过滤，取连续滤液。

2.4 专属性试验 取“2.2”项下混合对照品溶液和“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果各组分峰形良好，无干扰成分。

2.5 线性关系的考察 取上述混合对照品溶液0.5、5、10、15、20、30 μL，按“2.1”项色谱条件测定。对照品进样量作为横坐标(X)，峰面积作为纵坐标(Y)，进行线性回归。结果显示松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷的线性范围分别为0.295～17.7、0.07～4.2、0.007 5～0.45、0.007 5～0.45 μg(r≥0.999 8)。见表1。

表1 4种成分的回归方程和线性范围

2.6 精密度试验 吸取混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积。结果松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷峰面积的相对标准差(Relative Standard Deviation，RSD)分别为0.31%、0.98%、1.87%、0.88%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 吸取“2.3”项下供试品适量，按照“2.1”项色谱条件依次进样，于0、2、4、12 h测定，记录峰面积。结果松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的峰面积RSD值分别为1.49%、1.78%、2.60%、2.21%，表明在12 h内供试品稳定。

2.8 重复性试验 取同一批肉苁蓉样品，按照“2.3”项平行配制6份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的峰面积RSD值分别为2.11%、3.09%、2.30%、3.07%，具有良好的重复性。

2.9 加样回收率试验 称取已知含量的肉苁蓉样品0.3 g，共6份，依次加入适量对照品溶液(松果菊苷0.95 mg/mL，肉苁蓉苷A 0.56 mg/mL，管花苷A 0.30 mg/mL，毛蕊花糖苷0.31 mg/mL)，并以50%甲醇补足至50 mL，按“2.1”项色谱条件进行测定，记录峰面积并计算平均回收率。结果松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷平均加样回收率分别为101.14%、102.14%、96.91%、97.22%，RSD分别为0.89%、1.49%、2.99%、1.15%，加样回收率良好。

3 相对校正因子计算及耐用性考察

3.1 相对校正因子的计算 准确吸取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样5、10、15、20、30 μL，以松果菊苷为内标(s)，计算肉苁蓉苷A(a)、管花苷A(b)、毛蕊花糖苷(c)的相对校正因子fsa、fsb、fsc，结果见表1。

fs/i=fs/fi=As×Ci/(Ai×Cs)。

As、Cs分别为内标峰面积和质量分数，Ai、Ci分别为待测成分的峰面积和质量分数。

表2 肉苁蓉3种苯乙醇苷类成分相对校正因子

3.2 待测组分色谱峰定位 以松果菊苷(内标)为基准峰，计算肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的相对保留值、保留时间差，其在色谱图中的位置见表3。

3.3 考察不同色谱柱对校正因子和相对保留时间的影响 吸取“2.1”项混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件下进样，考察不同色谱柱(Symmetry C18、

表3 肉苁蓉3种苯乙醇苷类成分相对保留值和保留时间差

X-Peonyx AQ-C18、Eclipse Plus C18)对相对校正因子的影响，结果相对校正因子的RSD值均小于5%，表明使用不同色谱柱均具有良好的重现性。见表4。

表4 不同色谱柱对相对校正因子的影响

3.4 考察不同柱温、流速对校正因子的影响 吸取“2.1”项混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件下进样，分别考察0.9、1.0、1.1 mL/min 3个体积流量，25、30、35 ℃ 3个柱温对相对校正因子的影响。相对校正因子不受体积流量和柱温的变化而变化。见表5。

表5 不同因素对相对校正因子的影响

4 样品含有量测定

采用外标法和一测多评法分别测定6批肉苁蓉药材中4种苯乙醇成分(松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷)的含量，2种方法的结果相对误差较小，说明一测多评方法准确可靠；四翅滨藜寄生肉苁蓉苯乙醇苷成分含量高于梭梭寄生肉苁蓉。见表6。

表6 肉苁蓉含量测定结果(mg/g)

5 讨论

中药成分复杂，单一成分不能反映药物质量，因此，中药质量评价应选择多组分。张永等[23]应用QAMS同时测定肉桂药材中4种成分的含量，结果表明QAMS可行可用。侯文文等[24]应用QAMS同时测定出何首乌药材中4种蒽醌类成分，实现了同时测定并分析何首乌药材中的结合蒽醌和游离蒽醌，方法具有良好的可行性。木盼盼等[25]同时测定了葛根中9个异黄酮成分的含量，其结果与外标法差异无统计学意义。QAMS的提出，解决了中药成分、复杂活性成分多难以测定的问题，大大加速了中药成分检测的发展，同时测定了中药中的多指标成分，提供了一种更好的成分质量分析方法。但是目前QAMS仅应用于单味药，而在复杂的复方制剂中的应用较为局限，今后，应该大力开发和研究QAMS相关技术，有利于加快中药质量评价的发展，使中药更好地走向国际化。

结果表明，肉苁蓉的主要活性成分是苯乙醇苷类，包括松果菊苷、毛蕊花糖苷等，而肉苁蓉苷A和管花苷A价格昂贵，松果菊苷对照品来源相对丰富，价格便宜，易得，化学性质相对稳定。因此，选择其作为内标物进行一测多评试验，并测定了松果菊苷的含量，从而实现肉苁蓉多指标成分的质量控制。

本研究通过HPLC建立了一测多评法测定肉苁蓉中松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷含量的测定方法，并与外标法进行对比验证，结果2种方法的差异不明显，表明建立的相对校正因子准确可靠，方法简便、灵敏度高，可用于肉苁蓉中4种苯乙醇的含量测定。不同寄主植物肉苁蓉中4种苯乙醇含量以四翅滨藜寄生肉苁蓉含量较高，为肉苁蓉的质量控制提供了新的理论依据，从而实现了标准物质短缺情况下多指标组分的含量测定。