虎乳灵芝活性成分及药理作用研究进展

朱玥彤 高绪卿 李一冰 安百强 段应策 刘成伟，2

(1 东北林业大学生命科学学院，哈尔滨，150040; 2 黑龙江省酶与类酶工程重点实验室，哈尔滨，150040)

虎乳灵芝[Lignosusrhinoceros/Lignosusrhinocerotis(Cooke)Ryv]，是一种多孔二聚体的药用蘑菇，隶属于真菌门，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，多孔菌目(Polyporales)，多孔菌科(Polyporaceae)，虎乳灵芝属(Lignosus)[1-2]。其主要分布在中国南部(海南地区)、印度尼西亚、菲律宾、斯里兰卡、澳大利亚、泰国、马来西亚等热带地区[3]。虎乳灵芝作为一种中药材，富含多糖、萜类、脂肪酸、蛋白质等多种生理活性成分[4]，具有抗氧化、抗癌、抗增殖、免疫活性等多种药理作用[5]，在临床上常被用于治疗发热、百日咳、哮喘、癌症和胃溃疡等多种疾病[2]。因此，虎乳灵芝被认为是最具有开发前景的药用真菌之一[2]。近年来，由于人类大规模的采摘，导致虎乳灵芝的野生资源枯竭，而且目前的人工栽培技术仍无法满足大规模的商品化生产。为了更好地开发和利用虎乳灵芝，加速这一珍贵药用真菌的应用，本文对其生长栽培、营养成分、活性物质、药理作用及基因组学5个方面的研究进展进行综述。

1 生长栽培

虎乳灵芝的成熟形态由菌核、菌柄和菌盖3部分构成。其中，药用部位菌核表现为不规则的硬质团块，直径为1～5 cm，皮层由交织的菌丝构成，含有大量的淀粉粒，上表面产生许多根状菌，并渗透到菌核中。外表皮粗糙，颜色多呈灰褐色[6]。见图1。虎乳灵芝的整体形态与虎奶菇类似，但虎奶菇属于伞菌目侧耳属，且生药学方面已鉴定了二者有很大的不同[7]。虎乳灵芝菌丝生长的最适温度为30 ℃，培养基最适pH值为6～7(中性微偏弱酸)，最适碳源为葡萄糖，最适氮源为硝酸钾和酵母粉[8-9]。虎乳灵芝的成熟菌丝体为白色，含有锁状联合的结构形态，由于菌核的形成需要较长的时间，因此虎乳灵芝整体的生长周期较长，从菌丝体到形成菌核至少需要3个月[10]。虎乳灵芝的栽培方式也是多种多样的，主要有固体栽培和液体培养。其中，固体培养主要是利用农业废弃物作为基质进行栽培驯化。Jamil等[11]以木屑89%、米糠10%、石膏1%为基质进行覆土栽培，在28～32 ℃的黑暗条件下培养出虎乳灵芝菌核。Abdullah等[12]使用不同比例的锯木屑，稻秆和油棕榈空果穗结合废弃酵母作为基础培养基进行栽培，并筛选出木屑、稻秆和废酵母的最优配比为82∶10∶8，此时菌丝生长速度最快，为3.0 mm/d。而将成熟的基质掩埋在土壤中3～4周后则有菌核的形成，菌核鲜重在80～120 g之间。液体培养具有周期短、产量高、质量可控等优点，已被广泛应用。Lau等[13]以葡萄糖-酵母提取物-麦芽提取物-蛋白胨培养基用于液体发酵，并在静态条件下在25 ℃下培养或以150 r/min的往复式振荡器放置，15 d后获得虎乳灵芝菌丝体。但对虎乳灵芝的生长研究依然十分有限，具有药用价值的菌核生长周期较长，所以目前为止大规模化生产虎乳灵芝仍是一大难题。

图1 虎乳灵芝的不同形态(子实体与菌核)

2 营养成分

虎乳灵芝中含有丰富的碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素和灰分等多种营养成分[14]。对于碳水化合物的分布，研究发现虎乳灵芝子实体中碳水化合物比菌核至少高2倍[15]。纤维含量由多到少依次为:菌盖和菌柄(较高)，菌核(明显较低)。虎乳灵芝的蛋白质水平适中，除色氨酸外，所有必需氨基酸均存在[15]。而且不同发育阶段蛋白质含量和氨基酸组成不同，菌盖显著高于菌核和菌柄，子实体的蛋白质含量也远高于菌核，栽培的菌株比野生的菌株含有更多的蛋白质和水溶性物质[5，16]。虎乳灵芝中含有丰富的氨基酸，含量远高于其他常见蘑菇，具有很大的应用潜力。研究发现虎乳灵芝与其他药用菌一样，脂肪含量都很低，其中菌丝体中的脂肪含量高于子实体和菌核。虎乳灵芝含有核黄素(也称维生素B2)和烟酸(也称维生素B3)等常见维生素。其中，核黄素在各发育阶段均可检测到，而烟酸仅在虎乳灵芝菌丝和菌盖中存在，且在菌丝中含量更高[15]。虎乳灵芝不同部位总灰分含量存在差异，灰分含量由高到低的顺序为：菌盖>柄>菌核。另外，虎乳灵芝还含有许多矿物质元素，如钙、钠、钾、镁等，实验数据显示栽培得到的菌核中各项矿物质元素的含量均大于野生型菌核[5，16]。从营养成分上来说，栽培得到的菌核比野生型更好，因此栽培虎乳灵芝值得大面积推广。

3 活性物质

3.1 多糖 多糖是目前蘑菇中研究最广泛的活性物质。虎乳灵芝多糖主要由(1→3)-β-D-葡聚糖和(1→6)-β-D-葡聚糖共同组成[4]。这2种葡聚糖均具有抗氧化酶活性，促进分泌抗癌因子，刺激脾脏和胸腺细胞增殖等不同功能[17]。Wong等[18]在正常和无胸腺白变种实验室老鼠BALB/c小鼠中证实了虎乳灵芝提取物中的β-D-葡聚糖对肿瘤有抑制作用，可促进先天免疫细胞的增殖，同时刺激T细胞释放白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、IL-2、IL-6等抗肿瘤细胞因子。Hu等[19]以环磷酰胺诱导免疫抑制模型，对虎乳灵芝提取的4种多糖进行免疫调节活性的评价，发现虎乳灵芝多糖具有改善免疫器官，促进淋巴细胞增殖，刺激与抗肿瘤有关的主要细胞因子TNF-α和INF-γ的产生等重要作用。Veeraperumal等[20]发现虎乳灵芝中β葡聚糖可通过激活Rho蛋白依赖性途径加速肠上皮细胞增殖和迁移，可用作治疗胃肠黏膜损伤相关疾病(如消化性溃疡和炎症性肠病)的治疗剂。

3.2 活性蛋白 虎乳灵芝中的活性蛋白有凝集素、真菌免疫调节蛋白(Fungal Immunomodulatory Proteins，FIPs)、丝氨酸蛋白酶和纤溶活性蛋白等，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫增强、抗菌等多种药理作用。其中，凝集素是虎乳灵芝蛋白质中最丰富的一种糖蛋白，在细胞识别和黏着反应中起重要作用，具有多种药理作用。凝集素通过诱导IL-2和IFN-γ的基因表达，从而抑制结肠癌细胞和乳腺癌的生长，并且对人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)具有抗性[21]。虎乳灵芝的FIPs是一种具有抗肿瘤活性的生物蛋白，除免疫调节作用外，还可能用于肿瘤辅助免疫治疗[22]。目前，从虎乳灵芝菌核提取物中鉴定的Cerato-platanin亚型蛋白(是一组富含半胱氨酸的蛋白质，与某些植物致病真菌的毒力有关)，在对捕食者和寄生虫的防御中发挥重要作用[23]。

3.3 其他活性物质 除了多糖和活性蛋白以外，虎乳灵芝中还含有脂肪酸、黄酮、酚类、甾醇、萜类等多种药理作用的活性物质。虎乳灵芝中含有丰富的脂肪酸，包括不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸[14]。其中不饱和脂肪酸中含量最多的是亚油酸，其次是棕榈酸和立体位酸[13]。黄酮类化合物方面，有研究表明栽培虎乳灵芝(136.92±9.06)mg/g比野生型(110.84±5.89)mg/g含量更多，且具有较好的抗氧化效果[11]。Lau等[4]将虎乳灵芝的菌核切成小块并研磨成细粉，然后用冷水和热水分别进行提取，发现虎乳灵芝中含有具有抗氧化活性的酚类化合物，并且发现提取效果栽培型要好于野生型。Lau等[13]采用气相色谱法-质谱法联用(Gas Chromatograohy-mass Spectrometry，GC-MS)和超高效液相色谱-电喷雾电离-色谱质谱联用(Ultra High Performance Liquid Chromatography-electron Spray Ionization-gaschromatography-mass Spectrometry，UHPLC-ESI-MS/MS)对虎乳灵芝菌丝体和菌核中小分子化合物进行鉴定，发现了麦角甾醇(Ergosterol)，甾醇类Ergosta-4，7，22-trien-3β-ol以及羊毛脂烷型三萜类化合物。Yap等[24]将虎乳灵芝倍半萜合成基因在酿酒酵母中进行异源表达，得到了(+)香榧醇和α杜松醇倍半萜物质，药理试验显示该倍半萜化合物对乳腺癌细胞MCF-7具有不同程度的抑制作用，半数致死浓度(Median Lethal Concentration，IC50)分别为(3.5±0.58)μg/mL和(18.0±3.27)μg/mL。

4 药理作用

4.1 抗氧化作用 Yap等[5]对虎乳灵芝菌核的热水提取物(Hot Water Extract，HWE)、冷水提取物(Cold Water Extract，CWE)和甲醇提取物(Methanol Extract，ME)中抗氧化剂还原铁离子和清除自由基的能力进行考察，发现虎乳灵芝菌核的各种提取物均具有较高的2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)清除能力和自由基还原能力，铁还原抗氧化能力值范围为0.006～0.016 mmol/(min·g)。DPPH、ABTS、超氧阴离子清除自由基活性范围为0.52～1.12、0.05～0.20、0.98～11.23 mmol/g Trolox当量。Kittimongkolsuk等[25]研究发现DPPH自由基清除活性百分比ME、CWE、HWE测定中，百分比值分别为(12.08±0.77)%、(5.88±1.13)%和(4.78±1.21)%。其中，自由基清除能力由强变弱分别为ME、CWE、HWE。Nallathamby等[26]研究显示了有机试剂提取虎乳灵芝展现抗氧化活性具有重要影响，利用乙酸乙酯提取菌核的部分显示具有较高的ABTS+(36～86 mg TE/g提取物)(TE为生育酚当量，Tocopherol)清除活性和DPPH(21%～30%)自由基还原活性(61～122 mg TE/g提取物)。以上的研究也证明了有机试剂提取虎乳灵芝得到的抗氧化效果高于热水提取物。Lau等[13]采用甲醇和水(8∶2)为溶剂分别对虎乳灵芝的菌丝体，培养液以及菌核进行提取，以自由基清除活性、还原性、金属螯合活性以及对脂质过氧化的抑制作用等7种抗氧化指标作为检测标准，考察虎乳灵芝不同形态下的抗氧化效果，继而发现了菌丝和培养液的效果与菌核的效果一样甚至高于菌核的抗氧化效果，间接说明了虎乳灵芝的菌丝体在抗氧化效果上与菌核有相同功效，具有可替代的作用。Cai等[27]发现超声处理的虎乳灵芝多糖-硒纳米粒子(U-LRP-SeNPs)比未经超声处理的LRP-SeNPs具有更高的DPPH和ABTS自由基清除能力。其中LRP-SeNPs=1/10对ABTS和DPPH自由基的清除率分别为52.24%和22.09%，而经过超声处理以后的清除率分别为83.18%和52.31%。

4.2 抗增殖作用和抗肿瘤作用 Zaila等[28]通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]测定细胞活力的百分比，发现虎乳灵芝菌核甲醇加压液体提取物对人结肠癌细胞(Human Colon Cancer Cells，HCT)116具有抗增殖活性，水性加压液体提取的IC50为600 μg/mL，甲醇加压液体提取的IC50为1 200 μg/mL。而且对正常人结肠组织细胞CCD-18Co(正常人结肠组织细胞的一种)未显示出显著的细胞毒性，同时也说明不同萃取液极大影响了虎乳灵芝的抗增殖活性。Lee等[29]发现虎乳灵芝菌核的CWE在15.6～1 000 μg/mL浓度范围内对人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549均有抑制增殖活性，IC50分别为96.7 μg/mL和466.7 μg/mL，但对人正常乳腺和肺细胞系无明显的细胞毒性作用，实际起到抗增殖活性的为高分子量部分，碳水化合物(68.7%)和蛋白质(3.6%)，IC50为70.0 μg/mL和76.7 μg/mL。Yap等[30]研究发现虎乳灵芝TM02中的丝氨酸蛋白酶对乳腺癌细胞MCF-7表现出较强的选择性细胞毒性，且发现所有蘑菇中的F5丝氨酸类蛋白酶均具有抗癌作用。Wong等[31]发现虎乳灵芝菌核中提取的多糖可促进激活人CD56+自然杀伤细胞和正常脾脏的巨噬细胞等先天免疫细胞的增殖，同时可以促进辅助性T细胞和人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞的增殖。虎乳灵芝中活性蛋白对肿瘤细胞也有抗增殖和抑制作用。Lau等[4]发现虎乳灵芝菌核CWE的细胞毒性(IC50：37～355 μg/mL)比热水提取物(IC50>500 μg/mL)强，且对所有实体瘤均有细胞毒性作用，其中，虎乳灵芝对MCF-7、A549、HL-60、K562、THP-1等癌细胞的IC50分别为96.7、466.7、100、400 μg/mL和>400 μg/mL。

4.3 抗菌和抗病毒活性 Mohanarji等[32]采用抑菌圈法的方法测定了虎乳灵芝菌核提取液对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌等15种细菌和白色念珠菌、热带念珠菌、克鲁西念珠菌和总状念珠菌4种真菌的抑菌活性，发现虎乳灵芝菌核提取液对革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌和真菌均具有较强的抑菌活性。Katas等[33]以虎乳灵芝菌核提取物作为还原剂，以壳聚糖(Chitosan，CS)作为稳定剂来合成金纳米颗粒(CS-AuNPs)，发现金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌属、铜绿假单胞菌和大肠杆菌在低密度脂蛋白浓度为0.0125 g/mL下，抑制圈分别为(11.4±0.3) mm、(11.1±0.1) mm、(15.4±0.1) mm、(14.7±0.4) mm，说明CS-AuNPs对革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌和大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌)均表现出有效的抗菌活性。另外，虎乳灵芝提取物对于伤口中的某些病原菌和真菌均具有抗菌活性，甲醇和水提取物对除化脓性链球菌和黏液性链球菌外其他病原菌均有最大抑制，且水提物对大部分病原菌的抑菌活性显著高于甲醇提取物。虎乳灵芝菌核提取物可抑制登革病毒Ⅱ型活性[34]，并且还具有抑制HIV的蛋白酶和逆转录酶活性的作用，影响其正常生长与增殖[35]。

4.4 抗炎作用 Nallathamby等[26]发现虎乳灵芝热水和乙醇提取物对RAW264.7巨噬细胞均具有抗炎作用，作用机制为虎乳灵芝的亚油酸可以减少提取物中一氧化氮的产生，并下调脑小胶质细胞中神经炎症性诱生型一氧化氮合酶和环氧合酶2基因的表达，其中，乙醇提取物还可增加白细胞介素10的表达，从而实现其抗炎的效果。

4.5 细胞毒性 Phan等[36]研究发现虎乳灵芝水提液对小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH/3T3)，小鼠神经母细胞瘤细胞，正常人乳腺(184B5)和肺(NL20)细胞均没有细胞毒性；虎乳灵芝菌核的乙醇提取物对正常人结肠(CCD-18Co)、肾脏(HEK-293)、鼻咽(NP69)、口腔(OKF6)、大鼠肾脏(NRK-52E)和Vero细胞株的细胞活力均无影响[28]，发现只有CWE对各种癌细胞均有细胞毒性[37]。

4.6 促进消化 Gao等[38]通过将虎乳灵芝的不可消化碳水化合物进行体外发酵，以乳果糖为阳性对照，发现其含有丰富的膳食纤维，可促进肠道蠕动，并可促进长双歧杆菌和短乳杆菌的生长。

4.7 促进神经突的形成 Greene和Tischler[39]发现虎乳灵芝菌核的提取物(发挥作用的主要是粗多糖)可以刺激PC-12细胞，从而使PC-12细胞分化为交感神经元，并延伸轴突生长，且虎乳灵芝提取物对PC-12细胞无细胞毒性作用[40]。Farha等[41]研究发现每日口服低剂量虎乳灵芝菌核水提物可促进受损坐骨神经功能恢复，说明虎乳灵芝提取物能够促进神经损伤后运动和感觉功能的恢复，并且对神经组织无细胞毒性。

4.8 抗肥胖及降血压作用 Lau等[4]和Lee等[42]研究发现低脂、高钾、高钠含量的虎乳灵芝对高血压和心脏病患者的治疗有益处，虎乳灵芝中含有的油酸可以降低胆固醇和降低心血管疾病的发病率，它所含有的β-葡聚糖也可以降低胆固醇。

4.9 松弛预收缩气道作用 Lee等[42]从虎乳灵芝CWE中获得的不同分子量组分，高分子量(High Molecular Weight，HMW)和中分子量(Medium Molecular Weight，MMW)在松弛预收缩气道方面表现出更好的功效，此外，HMW组分显著抑制了卡巴胆醇，5-羟基异丙胺和钙诱导的气道收缩，并发现在HMW和MMW级分中含有的多糖-蛋白质复合物或蛋白质有助于支气管减速效应。Muhamad等[43]发现虎乳灵芝菌核提取液可以显著抑制小鼠肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞和肺淋巴结引流中辅助性T细胞的细胞群数量，并且能够降低血清免疫球蛋白的Th2细胞因子水平。

5 虎乳灵芝基因组的研究

随着基因组测序的不断深入，虎乳灵芝基因组在2014年已经被报道，基因组大小为34.3 Mb，得到假定基因为10 742个[6]。Yap等[6]在虎乳灵芝的基因组测序中发现了2个公认的免疫调节蛋白基因(GME7566和GME10641)，编码富含半胱氨酸的分泌蛋白和凝集素的基因是虎乳灵芝菌核中表达量最高的基因之一，有研究发现虎乳灵芝中唯一的聚酮合酶(Polyketide Synthase，PKS)基因是GME5066，它编码一个非还原性的PKS，该基因通常与芳香族聚酮的生物合成有关[43]。虎乳灵芝基因组中富含丰富的倍半萜生物合成基因[24]，其中，GME3634、GME3638和GME9210这3个基因为高表达合成倍半萜的基因。有研究发现，虎乳灵芝的基因组序列中的一个开放阅读框(GME631_g)，可能参与具有抗氧化能力的三萜生物合成[6]。

6 展望

本文对虎乳灵芝的生长栽培、营养成分、活性物质和药理作用等进行了总结，旨在对虎乳灵芝进一步开发和利用提供参考依据。虎乳灵芝的菌核具有较高的药用价值，而菌核提取物也具有多种药理作用，如具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌和抗病毒的重要活性。虎乳灵芝对大多数正常细胞有较弱或没有细胞毒性作用，对内脏器官也没有不利影响。虎乳灵芝自身富含对人类代谢有益的核黄素和烟酸，对胃肠道健康有益。该菌核提取物不仅对神经无细胞毒性作用，而且对于神经的生长和神经损伤恢复有极大的促进作用，还可提高人的耐力和警觉性。虎乳灵芝提取物还有具有抗炎的效果，研究发现乙醇提取物比热水提取物消炎效果更好[6]。

近年来，由于虎乳灵芝供需不平衡，导致其栽培技术更加珍贵。而液体发酵可以针对性地增加次生代谢物的产量等优点，因此，液体发酵有望成为开发虎乳灵芝活性物质的重要方式。随着基因组中次级代谢相关基因逐步被解析，从虎乳灵芝中挖掘新的活性天然产物越来越受到重视。相信随着生物合成技术的发展，虎乳灵芝这一物种的广泛栽培和活性物质的生物合成进一步研究及开发将成为可能。