川贝母不同规格鳞茎的生理指标和生物碱含量比较分析

王 业 冯 雪 高 旦 谢慧敏 付绍兵 李西文

(1 中国中医科学院中药研究所，北京，100700； 2 京都念慈菴总厂有限公司，香港，999077)

贝母药材是贝母属植物的复合群，该属多种植物的干燥鳞茎均具有一定的药用价值[1]，用于止咳化痰平喘，对治疗呼吸系统疾病疗效显著[2-3]。2020版《中华人民共和国药典》共计收录川贝母、浙贝母、伊贝母、湖北贝母、平贝母5种贝母类药材，来源于11种贝母属植物。目前，共计约1 529种中成药含有贝母属植物，占止咳类产品的19.28%[3]。庞大的市场需求刺激贝母药材的生产，然而，贝母类药材供应主要依赖野生资源，但不足市场需求的10%，亟待通过人工栽培途径缓解紧张的供需矛盾。

药材等级规格是传统评价药材质量的主要参考指标之一，不同等级规格药材化学成分含量差异显著，相同用量疗效差异明显[4-5]。如薤白传统用药以个大为佳[6]；肉苁蓉以个长、中部直径大、每千克根数少为一等货[7]；丹参规格等级划分以个长、质重作为划分标准[8]；川芎药材等级以个大、质重为选货一等[9]。贝母属植物鳞茎直径一般会随着生长年限的增加不断增大[10]。传统贝母药材推荐使用小而白的鳞茎，清代刘云在《本草述》中记载：“川贝母小而尖白者良……”[11]；化学成分含量的比较表明贝母总生物碱含量随着生长年限的增加逐年降低[12]。赵倩等[10]对不同规格平贝母(Fritillariaussuriensis)化学成分进行分析比较，发现最小粒径(直径6.5 mm左右)鳞茎总生物碱和单体生物碱含量均最高，质量最佳。

川贝母(F.cirrhosa)为贝母属(Fritillaria)植物，主要分布在西藏、云南、四川、青海等地[3,13-14]。目前川贝母已基本实现区域化人工栽培，用以缓解生境狭窄导致的野生资源短缺和市场供需矛盾[15]。尽管野生采挖的川贝母鳞茎难以准确鉴定生长年限，一般开花的植株都至少达到4年生。新鲜鳞茎的直径大小和外观形状存在差异，尤其是不同产地间因群落类型和土壤状况差异会导致川贝母鳞茎规格多样性。然而，从野生到引种过程中，由于缺乏稳定的品系或栽培品种，人工种植的川贝母表型多样性更加突出。目前针对鳞茎表型多样的研究，已有部分报道。在栽培过程中川贝母的鳞茎质量受多种因素的影响，如融雪时间、土壤含水量、气温等[16-17]；遮阴也会影响川贝母叶片光合特性，进一步影响鳞茎产量和品质[18-19]。传统性状评价发现川贝母的总生物碱含量和鳞茎高度及其直径负相关，即总生物碱含量随着鳞茎增大而降低[20]。向丽等[21]通过对川贝母地上性状和地下鳞茎的相关性分析，发现2～3年生鳞茎的大小和株高呈极显著相关性[21]。因此，鳞茎直径和形状的变化可能直接影响川贝母地上表型的变化，如果为开花期鳞茎，则进一步影响川贝母果实的形成和发育。但是，鲜有文献系统开展川贝母人工栽培过程中不同规格种茎对其产量和药材品质影响的研究，有必要从源头对不同表型的川贝母鳞茎生长发育进一步研究，以期为新品种的选育和生产不同功效用途的药材奠定基础，突破川贝母药材产业化中优良“种子”瓶颈。

本文通过大田栽培比对试验，整合川贝母植株的农艺性状、光合特征和总生物碱含量测定，综合评价鳞茎筛选对川贝母田间栽培的重要意义，以期为贝母属其他重要药用资源的高产优产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品 试验材料选用生长年限相同的川贝母“灯笼花”时期鳞茎，按照直径大小分为3个规格：大粒鳞茎(直径=46.74～30.10 mm)、中粒鳞茎(直径=30.10～21.71 mm)和小粒鳞茎(直径=21.71～12.70 mm)。在大粒鳞茎的筛选基础上，按照外观形状分为：尖形鳞茎(高/直径>1)和扁形鳞茎(高/直径<1)。

1.1.2 试验试剂 西贝母碱(纯度>98%，北京金克隆生物技术有限公司，货号：BP6122)，三氯甲烷(天津市大茂化学试剂厂，批号：20210104)，甲醇(天津市大茂化学试剂厂，批号：20210104)，氢氧化钠粉末(天津市富宇精细化工有限公司，批号：20210625)，溴甲酚绿(北京金克隆生物技术有限公司，货号：CS6218)，磷酸二氢钾(北京金克隆生物技术有限公司，货号：CS7728)，浓氨试液(天津市大茂化学试剂厂，批号：20210601)。

1.1.3 仪器 烘箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHG-9070)，多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司，型号：BO-1000S1)，水浴锅(北京华港通科技有限公司，型号：HH-8)，万分之一电子天平(常州市幸运电子设备有限公司，型号：FA1004E)，便携式光合仪(LI-COR公司，美国，型号：LI-6800)，紫外-可见光分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，型号：752)，纯水机(杭州亿捷科技有限公司，型号：UPTC-10)。

1.2 试验方法

1.2.1 田间试验 试验基地位于青海省海东市互助土族自治县林川乡保家庄川贝母规范化种植基地(青海绿康生物开发有限公司，东经36°59′，北纬101°59′)，海拔3 050 m，属大陆寒温带气候，土壤类型为高山草甸土。大粒(D)、中粒(Z)、小粒(X)、尖形(J)、扁形(B)鳞茎各200粒，每组设立3组重复，分别于2020年10月1日播种，株距10 cm，行距10 cm，不同观察组空出30 cm保护行和作业道，底肥使用农家肥，上覆麦秸。

1.2.2 农艺性状测量 川贝母5月初开始出苗，从2021年5月1日开始，每隔15 d统计D、Z、X、J、B 5个分区的出苗数；盛花期在每个分区随机挑选20株健康植株，分别测量株高(cm)、基部对生叶高(cm)、直径(mm)、叶片数(枚)、叶长(mm)、叶宽(mm)、两片叶夹角(度数)、花数(朵)；倒苗期每个分区随机采收20株健康植株的成熟果实，并测量和统计果长(mm)、直径(mm)、饱满数(粒)、不饱满数(粒)、果实重(g)、果壳重(g)等，同时计算果实饱满种子率。

1.2.3 光合光响应曲线测定 分别选取不同分区种植的川贝母长势一致的健康植株，以顶端幼嫩的叶片作为测量对象。选用LI-6800便携式光合仪辅助6800-01F荧光叶室进行光合光响应曲线的测定，测量过程使用CO2小钢瓶控制叶室中叶片周围相对稳定的CO2浓度。环境设置项下开启流速，设置流速500 μmol/s；开启水分，并将湿度设置为55%，开启CO2，并设置CO2浓度为400 μmol/mol；开启混合风扇，设置风扇转速为10 000 r/min。匹配选项设置为Always match，夹上叶片，待环境设置参数稳定后，选择Auto Programs标签和Light Response，设置光强梯度(Qin Values)为2 400、2 100、1 800、1 500、1 200、1 000、800、600、500、400、300、200、150、120、90、60、40、20、0 μmol/(m2·s)，进行光合光响应曲线的测量。

1.2.4 生物碱含量测定

1.2.4.1 供试品溶液的制备 倒苗期分别取D、Z、X、J、B 5个分区的植株，去除地上部分，取地下鳞茎用自来水清洗干净，趁鲜切片，于烘箱60 ℃烘干至恒重。干燥鳞茎用研钵研磨成粉末，过三号筛。精密称定过筛之后的粉末约2 g于具塞锥形瓶中，加浓氨试液3 mL浸润1 h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液40 mL水浴加热(80 ℃)回流2 h，冷却至室温后滤过，用适量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗涤药渣3次，合并滤液置50 mL容量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(4∶1)的混合液定容至刻度，混匀。精密量取5 mL提取液于25 mL具塞试管中，水浴蒸干后加10 mL三氯甲烷溶解，精密加水5 mL，继续加0.05%溴甲酚绿缓冲液2 mL，剧烈振摇1 min，分液漏斗静置30 min，用干燥滤纸滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.4.2 标准曲线的绘制 精密称定西贝母碱适量，加三氯甲烷溶液溶解制成对照品储备液。精密量取0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、1.0 mL对照品储备液，分别置于25 mL具塞试管中，分别加三氯甲烷至10 mL，再分别精密加5 mL水和2 mL 0.05%溴甲酚绿缓冲液，剧烈振摇1 min，转至分液漏斗静置30 min，用干燥滤纸滤过，取续滤液。以相应的试剂为空白溶液，在415 nm波长处测定不同浓度对照品溶液的吸光度；以吸光度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程和相关系数。

1.2.4.3 西贝母碱含量测定 量取1 mL供试品溶液，按照1.2.4.2项下的方法，平行测定3次，取平均值。将测定的吸光度代入线性回归方程，计算各样品中总生物碱的含量。

1.2.4.4 方法学考察 精密度考察：精密量取西贝母碱对照品溶液，连续测定3次吸光度，计算相对标准差(Relative Standard Deviation，RSD)值，评价精密度。复性考察：取同一批样品粉末6份，按照1.2.4.1的方法制备供试品溶液，按照1.2.4.2的方法制作的标准曲线，测定吸光度，计算RSD值，评价重复性。稳定性考察：随机取供试品溶液1份，放置0、2、4、8、10、12 h，分别测定吸光度，计算RSD值，评价稳定性。

1.2.5 数据处理 使用Excel 2021进行数据记录和整理；光合光反应曲线拟合使用Ye等[22]创建的在线软件，使用直角双曲线、非直角双曲线和指数方程3种拟合方法，对Pn-光响应数据进行模拟；使用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析，Levene方差检验，方差齐性(P>0.05)使用Duncan法检验显著性，否则用Dunnetts′s T3检验显著性，显著性水平为0.05；使用Origin 2021进行图的绘制。

2 结果

2.1 不同规格鳞茎川贝母生理性状比较 试验筛选的大粒鳞茎平均直径(35.26±3.28)mm，中粒鳞茎平均直径(26.49±2.02)mm，小粒鳞茎平均直径(19.85±2.81)mm；3种规格的鳞茎直径差异有统计学意义(P<0.01)，中粒鳞茎和大粒鳞茎直径分别是小粒鳞茎的1.5和2倍。尖鳞茎平均高/直径比值大于1，扁鳞茎平均比值小于1。见图1。

图1 不同规格鳞茎川贝母比较

6月下旬川贝母进入盛花期，比较不同规格鳞茎地上性状发现，3种规格鳞茎对应的性状中，基部对生叶高和基部对生叶夹角比较差异无统计学意义；株高、茎基粗、叶片长度和开花数比较差异有统计学意义(P<0.05)，且这4个性状均随着鳞茎直径的增大表现出显著的数量优势，其中鳞茎直径越大，株高越高，茎基越粗，叶片越长，开花数越多；大粒鳞茎的叶片数显著高于其他2种直径的鳞茎(P<0.05)；小粒鳞茎的叶片宽度显著低于其他2种直径的鳞茎(P<0.05)。比较不同形状鳞茎的地上性状发现，扁鳞茎叶片数显著多于尖鳞茎(P<0.05)；扁鳞茎地上叶片宽度极显著大于尖鳞茎(P<0.01)，其他统计的地上性状比较差异无统计学意义。见表1。

表1 不同规格鳞茎川贝母生理指标比较

由表1可知不同规格鳞茎开花数目差异有统计学意义，不同形状鳞茎开花数比较差异无统计学意义，所以进一步对不同规格鳞茎单株开花数进行统计，发现大粒鳞茎单株开花2朵到5朵不等，开3朵花为优势种群，占比47.37%；中粒鳞茎开花1～5朵不等，但中粒鳞茎中近20%开1朵花，开2朵花为优势种群，占比50.60%；小粒鳞茎未见开4～5朵花的植株，单株开花数集中在1～3朵花，开1朵花的植株占比较高，达63.04%。见图2。

图2 不同直径鳞茎川贝母单株开花数目比较

倒苗期采集不同植株干燥成熟果实，比较不同直径及形状鳞茎生长的果实质量。其中，不同直径鳞茎比较的结果发现，果实长度和鳞茎直径变化成正比，即果实长度随鳞茎直径膨胀变长。不同直径鳞茎单颗果实饱满种子的数目、单颗果实饱满率及饱满种子重量没有显著性差异。大粒鳞茎单颗果实重量、瘪种子数目及果壳重均显著高于其他2种直径的鳞茎(P<0.05)。外观性状观察也发现大粒鳞茎结出的果实果壳质地比较坚硬，其他直径的鳞茎结果果壳则相对酥脆。不同形状鳞茎的果实性状参数之间比较差异无统计学意义。见表2。

表2 不同规格鳞茎川贝母果实性状比较

从5月初开始统计D、Z、X、J、B不同分组不同时间的出苗数。比较不同直径川贝母的出苗数，发现大粒鳞茎出苗相对较早，统计开始近20%已经出苗，其他鳞茎出苗相对较少，且大粒鳞茎齐苗速率相对较快。见图3A。小粒鳞茎在出苗后期有部分植株由于疾病原因开始死亡。比较不同形状鳞茎相同时间段出苗情况发现，与扁鳞茎比较，统计前期尖鳞茎的出苗速度相对较快，后期出苗速率则变缓。见图3B。

图3 不同直径(A)和形状(B)川贝母鳞茎出苗时间比较

由于茎腐病和根腐病等原因，后期2种形状的鳞茎出苗数均存在一定程度的减少。田间观察发现，扁鳞茎在齐苗期仍有部分植株出苗，但是出苗植株比较弱小，没有开花趋势。

2.2 不同规格鳞茎川贝母叶片光合光响应曲线比较 通过对不同规格鳞茎的川贝母叶片光合光响应数据进行模型拟合，发现不同类型的鳞茎地上部分拟合模型差异较大。比较不同直径鳞茎拟合模型，根据拟合残差(残差越小，模型精确度越高)和决定系数大小(决定系数越大，模型拟合越贴近实际值)，大粒、中粒和小粒鳞茎最适拟合模型分别为非直角双曲线、直角双曲线和指数方程。不同形状鳞茎最适拟合模型均为非直角双曲线。基于最适拟合模型比较不同直径鳞茎的相关参数，结果显示，中粒鳞茎叶片的最大净光合速率最高，大粒鳞茎叶片的暗呼吸速率最高，小粒鳞茎叶片的光补偿点最高；不同形状鳞茎的比较发现，扁鳞茎的净光合速率、暗呼吸速率和光补偿点均高于尖鳞茎相关参数。见表3。

2.3 不同规格鳞茎川贝母总生物碱含量比较 相同的西贝母碱对照品溶液，连续测定5次吸光度，RSD为2.66%，表明仪器精密度良好。连续测定5次供试品溶液的吸光度，RSD值为2.66%，表明试验重复性良好。随机取供试品溶液1份，放置0、2、4、8、10、12 h，分别测定吸光度，计算RSD值为2.73%，表明供试液在12 h内稳定性良好。由前述方法计算所得标准曲线方程为：Y=25.374X-0.005 9(R2=0.994 5)，线性范围为0.000 6～0.011 1 mg/mL。

随着鳞茎直径的增大，总生物碱含量呈降低趋势。其中，大粒鳞茎和小粒鳞茎的总生物碱含量差异有统计学意义(P<0.05)，小粒鳞茎含量显著高于大粒鳞茎。2种不同形状的鳞茎总生物碱含量差异不明显。见图4。

表3 不同规格鳞茎川贝母光合光响应曲线参数比较

图4 不同规格鳞茎川贝母总生物碱含量比较

3 讨论

贝母属为多年生草本植物，鳞茎既是贝母属植物的营养器官又是繁殖器官，既可以作为种源又可以加工成商品药材，其直径及形状决定了植株的生长发育和商品规格。川贝母种植过程中，生产者经常会将4年生的鳞茎采挖，进行小密度种植，以利于结实[23]，获得数量多、健康饱满的贝母种子。本文通过比较不同直径鳞茎地上性状发现，大粒鳞茎对应的地上生物量特征表现出优势，从生理学角度分析，这可能与其淀粉和多糖等营养物质含量较高有关[10]。大粒鳞茎平均单株的花和果实数量较多，适于作为种茎繁殖获得种子投入生产。另外，种子圃在同样株行距下，获得等量的种子大粒鳞茎占用土地少，可节省土地流转面积，减少生产成本。田间调查发现，大粒鳞茎果壳比较坚硬，在秋季成熟期果实开裂的比例较小，可减少因果壳裂口导致的种子损失。大粒鳞茎单粒种子较大，种子萌发过程中可供胚萌发的营养物质较多，更有利于实生苗成长。同等生长年限的小粒鳞茎植株瘦弱，开花较少和结实率较低，因生殖发育消耗营养多，产出种子少，但总生物碱含量较高，建议作为商品进行加工。

不同光合响应模型是拟合光合响应曲线的重要工具，用于估测最大净光合速率、暗呼吸速率、光补偿点等关键参数，可进一步评价种质、逆境胁迫、施肥、生长环境等因素对植物光合生理的影响[24-33]。对不同直径大小鳞茎的比较发现，大、中粒鳞茎最大净光合速率较小粒鳞茎高，表明这2种鳞茎的地上部分可能更适应较高的光强[25]；田间观察发现，全光条件下大粒鳞茎地上部分叶片颜色较深，即使高温条件叶片仍可以保持正常生长状态，可考虑减少遮阴或不遮阴，大大降低生产成本；小粒鳞茎地上叶片颜色浅绿，叶片瘦弱，强光下抗逆性较低。暗呼吸速率随着鳞茎规格的增大而降低，说明暗环境条件下鳞茎越大光合产物消耗越少[25]。说明使用大粒鳞茎作为种源不仅抗性更高，对于下一年鳞茎的增产也有较大的潜力。

鳞茎规格受多种因素影响。其大小一般随着生长年限的升高而增大，过度采挖也会导致野生贝母鳞茎变小和土藏深度增加[34]。田间观察发现，“灯笼花”时期贝母鳞茎会在一定程度返回到“树儿子”或“一匹叶”的生长状态，退化的鳞茎会随之变小。已有文献多为针对贝母干燥鳞茎大小和质量关系的评价，普遍认为个头较小的松贝中总生物碱含量较高，质量最佳[10,12,20]。本研究也发现小粒鳞茎总生物碱含量显著高于大粒鳞茎，该结论和前人研究基本一致。因此，人为控制贝母生长环境，避免鳞茎太过膨大，培育小规格的鳞茎可能是生产高品质栽培品的有效方法之一。

本文通过整合川贝母农艺性状、光合特征、药材品质3方面因素，比较尖形和扁形鳞茎生物特性。发现与扁鳞茎相比，尖鳞茎统计前期的出苗速率更快，这可能是由于尖鳞茎在倒苗期到第二年鳞茎萌发阶段，打破休眠时间更早，具体原因有待进一步研究。田间观察也发现，早春阶段采挖2种不同形状的鳞茎，尖鳞茎已经可见顶芽冒出，扁鳞茎则少见新生的顶芽。扁鳞茎在齐苗期萌发的植株矮小且不开花，推测可能是植株本身营养物质积累不够，导致出苗时间较晚，加之当地在贝母生长后期温度下降，不适宜植株开花结果。对不同形状鳞茎的光合特征比较发现：扁鳞茎比尖鳞茎的最大净光合速率高，可能更适应强光环境；尖鳞茎暗反应速率低于扁鳞茎，暗环境条件下光合产物消耗较少。

此外，在生物碱测定过程中，不同规格鳞茎种有胶质和粉质2种类型的断面，前者断面呈现橘黄色，质地坚硬，粉性差，研磨困难，过三号筛之后粉末为浅灰色；后者断面呈现淀粉样白色，质地酥脆，粉性强，容易研磨，过三号筛之后粉末为纯白色。总生物碱含量测定结果发现胶质样品生物碱含量相对较高。同科植物重楼(Parispolyphylla)根茎也存在胶质和粉质2种类型，未见该现象的详细报道。

目前，种子繁殖仍然是贝母属药用植物扩繁的主要方式，种茎筛选对种子生产至关重要。本研究发现大粒鳞茎可作为川贝母种子生产的优良种源，小粒鳞茎可作为高品质药材的重要来源。该结论是通过对青海川贝母种植基地的材料进行试验发现的，这些植株在川贝母道地产区是否具有相同的生长及品质特性，还有待进一步研究。