补肾活血法治疗腰椎间盘突出症的用药规律和潜在分子机制预测

刘 剑 杨 雷 沈 浮 聂 颖

(1 湖南中医药大学第一附属医院，长沙，410007； 2 湖南中医药大学，长沙，410208)

腰椎间盘突出症(Lumbar Disc Herniation，LDH)是导致腰腿痛最常见的原因之一[1]，其主要病理学变化包括早期的纤维环内板层胶原网络的紊乱加之椎间盘髓核中蛋白多糖的丢失，导致椎间盘的水分减少，随着纤维环撕裂的加重，使得凝胶状的髓核组织突出并压迫腰骶神经根、马尾神经等邻近组织[2]。随着社会人口老龄化和人们生活方式的改变，LDH的发病率明显增加。LDH具有高致残率，给社会和家庭带来了沉重的负担[3-4]。然而大多数的LDH患者并不需要手术治疗。近年来，中医药治疗越来越受到人们的重视。LDH归属于中医学“腰痹”病范畴，病机多为本虚标实，其中以肾虚为本、瘀血为标，加之肾虚劳伤，感受寒湿之邪诱发经络闭阻，气血瘀滞而发病[5]。肾主骨，肾虚则元气不足，气血运行不畅，瘀血内生，腰府失养，日久凝结成痹，肾虚同时伴有血瘀，血瘀随时间迁移可出现肾虚，二者又能互为因果而成恶性循环[6-7]，因此补肾活血、标本兼治为目前LDH辨证论治的基本大法。

由于医家临证经验的差异性和中药本身的复杂性，补肾活血法在治疗LDH的临床运用中处方侧重各有不同，因此，从有效治疗LDH的临床方剂中挖掘用药规律及寻找核心方药并分析其作用机制，对于丰富补肾活血法的科学内涵及新药的开发具有重要意义。随着信息科学技术的高速发展，数据挖掘、生物信息学、网络药理学等新兴技术的应用极大地促进了中医药的科学认识，在解决中医药复杂性方面发挥了重要作用[8]。数据挖掘被公认为发掘核心配伍及处方潜在关联的重要工具[9]，为经验用药与现代医学搭建了桥梁，利于名医处方的梳理与挖掘，为方剂精准配伍与诊疗提供了新视角。而多组分、多靶点的中药方剂干预疾病的多种复杂因素大大增加了中药复方机制研究的难度，网络药理学作为药理学新兴分支学科，在揭示化学成分复杂的中药复方的药理学规律上具有独特的优势，并且其整体性、系统性与中医药的整体观、辨证论治等基本理论趋于一致，为中药复杂体系研究提供了新思路，为临床合理用药、新药研发等提供了新的科技支撑[10-11]。本研究利用数据挖掘联合网络药理学方法的新研究模式，对补肾活血法干预LDH的用药规律及机制进行综合分析，为补肾活血法的中医药经验提供循证医学理论支撑，为后续研究提供新的研究思路和策略。

1 资料与方法

1.1 文献来源 本研究的所纳入的处方均来自于国家知识基础设施数据库(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)，为保证文献的质量，文献的来源限定为“中国科技论文统计源期刊”“中国科学引文数据库”或“中文核心期刊目录总览”3类数据库，高级检索条件设置为(“腰椎间盘突出症”OR“腰椎间盘突出”)AND“肾虚”AND“血瘀”，阅读文献内容并提取肾虚血瘀相关LDH的中药处方，时间设定为2000年1月1日至2020年8月1日。

1.2 纳入标准 1)纳入的中药处方符合补肾活血法治疗LDH的相关临床研究文献，包括临床随机对照试验、临床案例报道、名老中医专家经验等；2)纳入的文献需有“肾虚血瘀型”“肾虚血瘀证”等辨证的相关描述；3)处方中各中药的组成需明确，对于多次复诊的临床病案只纳入首次处方；4)处方的疗效在文献中应明确记载有效。

1.3 排除标准 1)动物细胞实验、理论总结、系统综述等非临床相关研究文献；2)中药外治、离子导入等非口服药物治疗文献；3)方剂中药物组成不全面或单味用药的文献；4)剔除相同用药文献。

1.4 研究方法

1.4.1 药名规范化标准处理 依据2020版《中华人民共和国药典》对纳入药物名称标准化处置[12]，而炮制方法具有差异的或者同类药物不同称呼的进行名字的统一规范。

1.4.2 数据录入与核对 将筛选并规范后的处方录入中医传承计算平台V3.0(TCMICS V3.0)中的数据采集模块中，为避免录入时可能出现的纰漏，由2人负责核准相关数据，来确保数据录入准确性。

1.4.3 药物频次属性统计 依据药物出现的频次高低进行排序，并统计药物的四气、五味、归经信息，进行可视化展示。

1.4.4 组方关联规律分析 设置TCMICS V3.0平台中的“支持度个数”参数为17，“置信度”参数为0.5，点击用药模式、规则分析、网络拓扑并导出Excel及可视化，用以分析方剂药物的组方关联规律。

1.4.5 组方聚类规律分析 k均值聚类算法(k-means Clustering Algorithm)是基于迭代求解进行聚类算法的分析方法，其把任意研究对象支配于其距离最短的聚类中心，以达到最佳的聚类选择[13]。利用TCMICS V3.0平台中的k均值聚类算法与回归模型对处方进行聚类规则分析，聚类个数设置为5个，进行核心类方组合提取，并在核心类方的基础上模拟出新处方。

1.5 网络药理学研究

1.5.1 核心药物组合及类方的成分及靶点筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18筛选核心药物的活性成分及对应靶点，与GeneCards、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)数据库中获取的LDH靶基因相映射，获取核心处方干预LDH的潜在靶标，并建立药物-活性成分-靶标网络模型。

1.5.2 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建 将潜在靶点导入STRING 11.0，进行蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)分析，将结果导入Cytoscape 3.7.1软件，在Network Analyzer插件中以拓扑参数度值(Degree)大于中位数的2倍为关键靶蛋白，绘制核心PPI网络图。

1.5.3 基因本体富集分析和京都基因和基因组百科全书富集分析 利用R语言(clusterProfiler包)完成潜在靶点的基因本体(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，并进行可视化展示。

2 结果

2.1 药物频次统计分析 共筛选并整理出104首补肾活血法治疗LDH的中药方剂，共涉及中药233味，其中使用频次最高的分别是当归、牛膝、甘草、川芎、地龙。38味药物的使用频次大于10，小于10的药物有195味。药物使用频次超过15的药物见表1。

表1 补肾活血法治疗LDH处方中高频药物频次分布(频次≥15次)

2.2 药物性味归经功效统计 233味药的属性中，性温的中药所占比例最多，约50.6%；五味中味苦的最多，占32.5%；归经多属于肝、脾、肾，其占比分别为30.3%、16.3%、15.9%；功效多属于补虚类、活血化瘀类，其占比分别为28.7%、26.7%。见图1。

图1 补肾活血法治疗LDH用药性味归经功效规律统计

2.3 组方关联规律分析结果 关联较为密切的药物组合共44组。在药对组合模式中当归、牛膝的出现频次最高，为36次；在多味药组合模式中，当归、牛膝、川芎出现的次数最高，为23次；当归、川芎、红花、桃仁在4味药组合模式出现的频次最高，为18次。按药物组合出现频次由高到低排序见表2。核心药物网络展示见图2。

表2 补肾活血法治疗LDH处方中的药物组合分布情况(支持度≥17次)

图2 补肾活血法治疗LDH处方中核心药物网络

2.4 基于聚类分析的方剂组方规律分析 本研究前期进行聚类模拟中发现，将处方组合分为5类时，得到的聚类选择的处方最佳，其核心类方组合见表3。以当归、红花、川芎、桃仁、甘草为核心的活血化瘀类方组合的支持度最高，其代表方为身痛逐瘀汤和桃红四物汤加减，其次为牛膝、当归、川芎、独活、杜仲为核心的补肾活血类方，代表方为补肾活血汤。用不同颜色的节点表示不同类方的聚类药物，本研究纳入的处方药物基本在回归曲线的周围分布较为集中，表示本聚类可信度较高。见图3。

表3 补肾活血法治疗LDH处方中的核心药物类方

图3 补肾活血法治疗LDH处方中的核心药物类方回归模型

2.5 核心药物组合的成分及靶点筛选 核心药物组合以及核心类方进行网络药理学分析发现，当归(Danggui)、牛膝(Niuxi)、甘草(Gancao)、川芎(Chuanxiong)、杜仲(Duzhong)、红花(Honghua)、桃仁(Taoren)、黄芪(Huangqi)、秦艽(Qinjiao)、没药(Moyao)、乳香(Ruxiang)、独活(Duhuo)12位药物处于核心地位，对其进行活性成分筛选，核心药物共涉及活性成分178个，甘草、杜仲、没药活性成分占比较高，分别为29.3%、20.4%、14.3%。见图4A。核心药物的活性成分与LDH的交集靶标共有52个。见图4B。“药物-活性成分-疾病靶标”网络中共有节点244个，边839条，平均度值为6.8。其中MOL000098(槲皮素)、MOL000006(木犀草素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000358(β-谷固醇)、MOL000173(汉黄芩素)、MOL002773(β-胡萝卜素)为关键活性成分，其度值分别为47、20、19、17、16、15。关键靶基因为环氧合酶-2、雌激素受体1、雄激素受体、诱生型一氧化氮合酶、乙酰胆碱酯酶，度值分别为102、91、76、75、35。见图5。

图4 补肾活血法治疗LDH处方中的核心药物的活性成分分布情况及与LDH疾病的交集靶标韦恩图

图5 补肾活血法治疗LDH的核心药物的“药物-活性成分-疾病靶标”网络模型

2.6 PPI网络构建 PPI网络中共有节点46个，边126条，得到度值的中位数为5.3，以该值的2倍为核心靶蛋白，JUN、AKT1、IL6、MAPK1、VEGFA、FOS、MAPK14给出中文如IL(白细胞介素6)的度值符合核心靶蛋白的标准，成为补肾活血法干预LDH的核心靶蛋白。见图6。

图6 补肾活血法治疗LDH的PPI网络

2.7 GO及KEGG富集分析 预测得出潜在靶点的生物过程(Biological Process，BP)527条，细胞组分(Cell Component，CC)33条，及分子功能(Molecular Function，MF)82条，按照富集的基因数目进行排序，对排名前10位的条目进行柱状图展示。见图7。

共富集到135条信号通路。前15条通路见表4。补肾活血法核心药物干预LDH的潜在通路与TNF Signaling Pathway(肿瘤坏死因子信号通路)、IL-17 Signaling Pathway(IL-17信号通路)、MAPK Signaling Pathway(MAPK信号通路)、PI3K-AKT Signaling Pathway(PI3K-AKT信号通路)、HIF-1 Signaling Pathway(HIF-1信号通路)等炎性相关通路密切相关，在Th17 Cell Differentiation(Th17细胞分化相关通路)、T Cell Receptor Signaling Pathway(T细胞受体信号通路)等免疫相关通路基因富集数目较多。

图7 补肾活血法方剂核心药物干预LDH的GO富集分析

表4 补肾活血法方剂核心药物干预LDH组相关KEGG富集分析

2.8 补肾活血类方干预LDH的网络药理学机制 “药物-活性成分-靶点模型”中，类方的度值排名前5的活性成分均为：山柰酚、槲皮素、豆甾醇、β-胡萝卜素、β-谷甾醇。见图8。补肾活血类方中特有活性成分为当归素(Angelicone)、欧前胡素(Ammidin)等。活血化瘀类方中特有活性成分有紫花前胡苷(Nodakenin)、赤霉酸(Gibberellin)等。健脾补肾类方中特有活性成分有绵马酚(Aspidinol)、柚苷素(Naringenin)、佛手内酯(Bergapten)等。活血通络类方中特有活性成分为：蚓碱(Lumbritin)、溶蚓素(Lumbrolysin)、蚯蚓解热碱(Lumbrifebrine)等。见表5。

类方中共有活性成分干预LDH的靶蛋白中IL6、AKT1、IL1B、VEGFA、MAPK1、JUN给出中文如IL(白细胞介素6)的度值最高。而补肾活血类方、滋阴补肾类方、活性化瘀的特征性靶蛋白分别为多巴胺D3受体、胰岛素、维生素D受体，健脾补肾类方与白细胞介素17A、肿瘤坏死因子关系密切。活血通络类方中核心靶蛋白为C-X-C基序趋化因子配体8、核因子κB亚基1。见图9。

图8 补肾活血类方干预LDH的“药物-活性成分-靶点模型”

表5 补肾活血相关类方干预LDH的特征性活性成分

图9 补肾活血类方干预LDH的PPI模型

3 讨论

LDH作为一种退行性疾病，是长期腰腿痛、下肢神经功能受损的重要原因之一。大多数LDH患者可以通过药物、物理疗法以及类固醇注射等非手术治疗取得良好的临床效果，而强调辨证论治的中医药疗法作为我国传统医药的宝贵财富，其根据发病季节、特点和个体差异采用的个性化治疗策略在临床治疗LDH中具有独特疗效，且避免了西药的不良反应[14]。本病的病机主要由于肾精亏虚、生化乏源，肾精亏虚而主骨无力，从而出现下肢麻痛等不适[15]，中医认为“痹久多瘀”“血瘀”与“腰痹”互为因果关系，故“肾虚”为本，“血瘀”为标而发为腰痹[16]，因此，肝肾亏虚、瘀血内停为LDH的重要病机，所以施以补肾活血之法正切病机。

从宏观角度来探讨补肾活血法干预LDH的用药规律，本研究以肾虚血瘀型LDH为研究对象，对距今20年以内的相关核心杂志文献进行处方收集，利用中医传承计算平台软件进行药物频次统计分析得出，当归、牛膝、甘草、川芎、地龙的使用频次最高，在药物的属性中，四气归属性温的中药占比最多，且归经多属于肝、脾、肾经，功效多属于补虚类、活血化瘀类，这与本研究纳入的LDH属于肾虚血瘀的证型相符合。在中药的功效分析中，除补肾活血类中药以外，亦多见配伍祛风除湿、解表散寒之药，体现LDH病性多属于本虚标实、虚实夹杂，病机在本为肝脾肾不足，在标为寒湿之邪闭阻络脉。基于关联规则对补肾活血法治疗LDH进行组方规律分析，发现当归、牛膝药对出现频次最高。现代药理学研究表明，当归具有良好的抗炎活性及神经保护功效，当归提取物可降低脂多糖诱导的RAW264小鼠巨噬细胞一氧化氮和肿瘤坏死因子-α的产生以及诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2的表达，从而发挥抗炎作用[17]，且当归酮对小鼠成纤维细胞中神经生长因子的产生有促进作用[18]。牛膝总皂苷作为牛膝的主要活性成分，可通过沉默信息调节因子1自噬信号通路促进大鼠椎间盘髓核细胞存活和细胞外基质合成[19]。在4味药组合模式中，当归、川芎、红花、桃仁的组合处于核心地位，为《医宗金鉴》中桃红四物汤的主要成分，动物实验研究表明，能够显著降低血瘀模型大鼠全血、血浆及血清的黏度比，具有较好的抗血小板活化及抗血栓作用，从而达到中医意义上的活血化瘀作用[20]。因此，采用数据挖掘方法得出的高频中药，其治疗LDH亦有现代医学的基础。此外，采用k均值聚类算法得出的聚类方案中，将补肾活血法治疗LDH的处方用药分为5类时，回归模型提示，纳入药物集中分布于核心类方曲线周围，说明所得核心类方最具有代表性。核心类方的来源多为补肾活血汤、身痛逐瘀汤以及六味地黄汤中的药物，并且聚类处方除活血化瘀、补肾活血法支持度最高以外，通络、健脾、滋阴之法常配合补肾活血协同运用，体现补肾活血法干预LDH治法的灵活性。

对补肾活血法干预LDH的核心药物进行提取，发现当归、牛膝、甘草、川芎、杜仲、红花、桃仁、黄芪、秦艽、没药、乳香、独活12位药物处于核心地位，在“药物-活性成分-疾病靶标”网络模型中，槲皮素、木犀草素、山柰酚为关键活性成分，并作用于环氧合酶-2、雌激素受体1、雄激素受体等多个靶基因，体现补肾活血法干预LDH具有多成分、多靶点的特点。槲皮素、木犀草素均为抗氧化作用较强的黄酮化合物，槲皮素不仅具有神经保护功效，还能提高肌肉的抗疲劳耐性[21]，研究证实槲皮素在氧化损伤介导的神经退化模型中发挥神经保护作用，还可以通过抑制核因子κB通路激活减轻周围神经缺血再灌注损伤[22]，其可抑制Toll样受体4/核因子κB信号通路介导的炎症反应以及C-胱天蛋白酶3和Bax的表达水平，从而抑制细胞凋亡以减轻神经损伤[23]。槲皮素可通诱导过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活物-1α的表达，调节线粒体氧化酶的活性从而提高机体肌肉的疲劳耐受力[24]。木犀草素的多种药理活性被证实与其抗炎作用有关，其结构含有一定数目的酚羟基，可通过抑制一氧化氮合酶来减少一氧化氮的合成以发挥抗炎及抗氧化的作用[25]。山柰酚具有多种成骨生物活性，如抑制破骨细胞生成和诱导软骨生成[26]，其可通过降低炎症介质水平和通过抑制核因子κB P65的核移位来增加抗炎细胞因子(白细胞介素-10)以减轻炎症[27]。在类方的特征性活性成分中，虫类药物的使用使作用于LDH的靶点更为丰富，活血通络类方中的地龙含有丰富的蚓素，不仅具有良好的解热镇痛功效，还具有抗凝、促进血液循环的作用[28]。本研究对补肾活血法核心药物活性与潜在靶点有较高亲和力的成分进行预测，但未被报道的成分可后期开展药效实验加以验证，可为中药功效及标志物的发现奠定基础。

PPI网络模型提示补肾活血法核心药物组合通过JUN、蛋白激酶B1、白细胞介素6、促分裂原活化的蛋白激酶1、血管内皮生长因子A、FOS、促分裂原活化的蛋白激酶14干预LDH的可能性较大。JUN是一种快速反应早期基因，c-Jun氨基端激酶是促分裂原活化的蛋白激酶家族的重要成员，并参与病理性神经痛的发生[29]。椎间盘组织中的白细胞介素-6炎症介质在椎间盘退变的早期可显著增加，其在LDH神经损伤和病理性疼痛的发生中起重要作用，白细胞介素-6抑制剂可显著减轻慢性压迫模型大鼠的疼痛[30]。有学者利用白细胞介素-6基因沉默治疗LDH，可显著减轻脊髓神经早剥模型大鼠的机械性痛觉过敏[31]。蛋白激酶B1在退化椎间盘组织的新生血管的生长中也起着重要作用，而新的血管生成可能是一个负性因素，它可以招募炎症介质和细胞，加速基质破坏和退化过程[32]。血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)在椎间盘退变及病程进展中起关键作用，目前有学者提出VEGF的过表达可能是退变模型的椎间盘组织退变的始发因素，亦可能是自我修复以及自噬的结果[33]。而在类方的作用靶蛋白的结果中，五大类方所得共有的作用靶蛋白与核心药物组合的靶点类似，而每类处方作用的特征性靶点则各有不同，补肾活血类方、滋阴补肾类方、活性化瘀的特征性靶蛋白分别为多巴胺D3受体、胰岛素、维生素D受体，健脾补肾类方与白细胞介素17A、肿瘤坏死因子关系密切。活血通络类方中核心靶蛋白为C-X-C基序趋化因子配体8、核因子κB亚基1核因子κB亚基1，其中白细胞介素17A、肿瘤坏死因子均与炎症反应相关。有研究报道核因子κB亚基1在鼠髓核细胞炎症反应和凋亡中发挥促进作用[34]，维生素D受体的基因多态性同样影响着椎间盘退变的发生率[35]，而CXC趋化因子配体8以及多巴胺D3受体尚无文献报道其为LDH的相关靶点。

综上分析，补肾活血法干预LDH的靶点较为丰富，也侧面印证了中药复方干预疾病的复杂性。

在补肾活血法干预LDH的GO及KEGG通路分析中，关键通路主要与肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素-17信号通路、PI3K/AKT等炎症相关通路密切相关，在Th17细胞分化相关的免疫相关通路基因富集数目较多。现代研究证实了本预测结果中相关炎症通路在椎间盘退变中的关联性，白细胞介素-17A与椎间盘退变密切相关，其可通过介导肿瘤坏死因子-α信号上调退变模型小鼠髓核细胞ADMA-TS-7的表达来影响免疫缺陷病(Immunodeficiency Disease，IDD)的发生[36]，并且白细胞介素-17A可通过激活人退变髓核细胞中的磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B Pathway，PI3K/AKT)信号通路来抑制自噬，可能有助于开发未来的靶向治疗方法[37]。在髓核所处的复杂的细胞外基质微环境中，含有高水平的硫酸化蛋白聚糖，其通过与阳离子的相互作用，为组织提供其特有的生物力学特性，现代研究证实，PI3K/AKT激活能调节细胞生长、增殖、迁移和黏附，是控制聚集蛋白聚糖合成的重要途径[38]。自身免疫学说是LDH发病机制的重要组成部分，Th17细胞在许多免疫介导疾病的发病机制中起重要作用，Th17相关的细胞因子通过上调退变椎间盘细胞CC趋化因子配体20的分泌而形成一个正相趋化性反馈环，从而在退变椎间盘的发育中起作用[39]。因此，补肾活血法治疗LDH作用机制不仅涉及抑制局部组织的炎症反应，还可能通过调节全身免疫平衡的途径进行综合干预，这与中医药治疗疾病的整体观念不谋而合，亦体现了补肾活血法在痹证治疗中的科学内涵。

本研究亦有诸多不足之处。首先，本研究基于CNKI进行文献的收集，且纳入的数量有限，而对于补肾活血法的理解着眼于各医家自身的理解，以各医家医案处方的核心药物来代表补肾活血法，难免存在偏倚。其次，本研究纳入的核心药物的活性成分均来自TCMSP，由于TCMSP的局限性，地龙药物尚未纳入其中，且数据库并不能完全代表某个药物的所有活性成分，亦是本研究的局限之处。本研究的预测结果仍需要实验进一步验证。

综上所述，本研究运用数据挖掘和网络药理学方法，收集各医家补肾活血法干预LDH的处方进行用药规律及机制预测，一定程度上科学阐述了补肾活血法的科学性，对于后续机制探讨有一定的参考意义。