防风药材多指标综合质量评价及指纹图谱研究

陈 昊 李心愿 刘 霞 张雪琼 姚子豪 汪沁柔 熊富良

(1 武汉理工大学，武汉，430070； 2 武汉同济中维医药有限责任公司，武汉，430056)

防风是伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，习称公防风，最早收载于《神农本草经》，被列为上品，具有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效，主要用于治疗外感风寒、头晕目眩、风湿痹痛、骨节疼痛等病症[1-2]。防风含有色原酮类、香豆素类、多糖类等多种化学成分[3-9]，防风功效包括抗氧化、解热镇痛抗炎、抗肿瘤等[10-11]。

目前防风主要以产地进行区分，主要参考依据为《七十六种药材商品规格标准》，如把产于东北三省、内蒙古、河北张家口、山西雁北及陕西榆林者称“北防风”；产于河南、山西运城、陕西扶风者称“水防风”；产于云南者称“云防风”；产于四川东部万县、涪陵、宜宾者称“川防风”；产于青海、甘肃、宁夏者称“西北防风”；质量等级划分不合理，未进行纯度、有效成分含量、安全性等指标限量规定，导致防风质量参差不齐，影响了临床用药的安全有效[12-13]。

为客观、有效地评价不同产地防风药材的质量，研究收集了15批不同产地防风药材，结合防风含量测定、水分、灰分及浸出物等理化指标及防风指纹图谱，通过主成分分析等药理方法，构建防风药材综合质量评价方法，对防风药材进行多指标数据质量评价，为药材的质量评价提供更加直接的量化指标[14]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪(岛津公司，日本，型号：Shimadzu LC-16)；万分之一电子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型号：ME-204)、十万分之一电子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型号：XS205)、超声仪(昆山美美超声仪器有限公司，型号：KQ-3200B)、粉碎机(浙江红景天工贸有限公司，型号：DE-100)、烘箱(北京市永光明医疗仪器有限公司，型号：101-1)、水浴锅(常州国华电器有限公司，型号：HH-4)、电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司，型号：DZTW-2000)。

1.2 试剂与药材 甲醇(AR，成都科隆化学品有限公司，批号：2021111702)、乙醇(AR，湖南汇虹试剂有限公司，批号：202002251)、甲醇(HPLC，康科德，批号：2022MG001)、升麻素苷(纯度94.6%，中国食品药品检定研究院，批号：111522-201913)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(纯度97.4%，中国食品药品检定研究院，批号：111523-201811)、升麻素(中国食品药品检定研究院，批号：111710-200602)、纯水(娃哈哈，批号：202110122106HT)，其他试剂均为分析纯。

防风药材经武汉理工大学化学化工与生命科学学院刘霞副教授鉴定为防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.。防风药材信息见表1。

表1 防风药材信息

2 方法与结果

2.1 水分、浸出物、总灰分及酸不溶性灰分测定 按照《中华人民共和国药典》(2020版)对15批防风药材的水分、浸出物、总灰分以及酸不溶性灰分进行测定，15批防风药材的水分：含水量为8.7%～9.7%，平均含水量为9.3%，含水量均小于10.0%，符合《中华人民共和国药典》规定。15批防风药材的浸出物：浸出物含量为29.8%～36%，平均浸出物含量为33.3%，浸出物含量均大于13.0%，符合《中华人民共和国药典》规定。15批防风药材中的总灰分：总灰分为5.30%～6.38%，平均灰分为5.88%，总灰分均小于6.5%，符合《中华人民共和国药典》规定。15批防风药材中的酸不溶性灰分：酸不溶性灰分为0.8%～1.59%，酸不溶性灰分平均为1.41%，酸不溶性灰分均小于1.6%，符合《中华人民共和国药典》规定。见表2。

表2 15批防风药材的水分、浸出物、总灰分及酸不溶性灰分测定及RSD(%)

2.2 防风药材中升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：依利特Supersil ODS2 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-水为流动相，检测波长为254 nm，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，分析时间30 min。

2.2.2 对照品溶液的制备 取升麻素苷对照品及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，分别加甲醇制成每毫升各含60 μg的溶液，即得[1]。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品细粉约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定重量，水浴回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得[1]。

2.2.4 样品测定 分别精密吸取对照品溶液各3 μL与供试品溶液2 μL，注入液相色谱仪，测定，即得[1]。15批防风药材中升麻素苷的含量为0.187 6%～0.590 5%，平均值为0.348 9%；5-O-甲基维斯阿米醇苷含量为0.219 4%～0.408 0%，平均值为0.295 5%；二者总含量为0.428 4%～0.992 7%，平均值为0.644 3%；15批防风药材中升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷总含量均大于0.240 0%，符合《中华人民共和国药典》规定。见表3。

表3 15批防风药材的含量测定及RSD(按干燥品计算)(%，n=2)

2.3 多指标成分分析 采用SPSS 22.0统计软件对15批防风药材的浸出物、升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷3个指标进行标准化(Z-score法)处理。主成分分析数据见表4。提取特征值≥1的前2个成分，累计贡献率达到92.751%，结果表明前2个成分基本能代表原始数据所反映的信息，分析得到的线性组合表达式为：Y1=-0.659 9×X1+0.213 1×X2+0.720 3×X3；Y2=0.391 7×X1+0.915 9×X2+0.088 0×X3；F=0.571 18×Y1+0.356 33×Y2，将15批药材样品进行线性计算后，带入综合评价函数，计算综合得分值，分值越高，说明样品的综合品质越高。15批防风药材样品的综合得分见表5。FF-3批样品的综合得分最高，综合质量最优。

表4 主成分分析数据(%)

表5 15批防风药材样品综合得分值

2.4 防风指纹图谱的建立

2.4.1 色谱条件 采用Agela Innoval C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)以甲醇(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱，0～10 min，B相70%～55%；10～20 min，B相55%；20～30 min，B相55%～35%；30～45 min，B相35%～10%；45～60 min，B相10%；60～65 min，B相10%～70%；65～80 min，B相70%；流速为1.0 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为254 nm；进样体积为10 μL。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取升麻素、升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加甲醇溶解，制成每毫升含50 μg的溶液作为对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取防风药材粉末(过5号筛)约1.0 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定重量，超声30 min，放冷至室温后用甲醇补足减失重量，摇匀后滤过，用0.45 μm有机滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4.4 精密度实验 取防风药材粉末(编号：FF-1)，按“2.4.3”制备供试品溶液，色谱条件按“2.4.1”，连续进样6次，记录图谱，导入2004 A版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，显示各图谱间相似度均为1，各峰保留时间RSD值均小于3%，峰面积RSD均小于3%，说明该指纹图谱方法的精密度良好。

2.4.5 重复性实验 取防风药材粉末(编号：FF-1)，按“2.4.3”制备供试品溶液，平行6次，按“2.4.1”下色谱条件方法进样，记录图谱，导入2004 A版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，显示各图谱间相似度均为1，峰保留时间RSD值均小于3%，峰面积RSD值均小于3%，说明该指纹图谱方法的重复性良好。

2.4.6 稳定性实验 取防风药材粉末(编号：FF-1)，按“2.4.3”制备供试品溶液，按“2.4.1”下色谱条件方法，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，记录图谱，导入2004 A版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，显示各图谱间相似度均为1，共有峰保留时间RSD值均小于3%，共有峰峰面积RSD值均小于3%，说明样品溶液稳定性良好。

2.4.7 样品测定及分析 取各批次防风药材粉末，按“2.4.3”制备供试品溶液，按“2.4.1”下色谱条件方法记录色谱图，导入2004 A版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，S1-S15对应FF-1至FF-15，设置时间窗口为0.3 min，以中位数的方式生成对照指纹图谱。生成图谱见图1。得到8个共有峰，指认出3个成分。共有峰及指认峰结果见表6。相似度结果见表7。结果显示，15批防风药材相似度均>0.9，表明药材间相似度较高。

表6 15批防风药材共有峰峰面积RSD

表7 15批防风药材的相似度结果

2.5 指纹图谱分析

2.5.1 聚类分析 以15批样品8个共有峰面积为变量，运用SPSS 20.0统计软件进行聚类分析，采用组间连接法，利用平方欧氏距离作为样品的测度，对其进行系统聚类分析，得到聚类树状图。见图2。将样品大致分为2类，Ⅰ类为河南产防风，俗称水防风，Ⅱ类为河北、山西、内蒙古产防风，俗称北防风类，聚类分析结果说明产地对防风药材质量有一定的影响，聚类结果与“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”结果相似。

2.5.2 主成分分析 将15批防风药材的8个共有峰面积导入SPSS 20.0统计软件进行主成分分析。主成分分析数据见表8。提取特征值≥1的前3个成分，累计贡献率达到84.911%，结果表明前3个成分基本能代表原始数据所反映的信息，得到的线性组合表达式为：Z1=-0.219 5×Q1+0.501 6×Q2+0.062 6×Q3+0.546 1×Q4+0.225 9×Q5-0.175 0×Q6+0.323 7×Q7+0.460 1×Q8，Z2=0.528 1×Q1-0.215 0×Q2+0.427 4×Q3+0.072 1×Q4+0.375 5×Q5+0.459 9×Q6+0.357 3×Q7+0.083 1×Q8，Z3=-0.079 9×Q1+0.194 1×Q2+0.513 7×Q3-0.093 0×Q4-0.545 5×Q5+0.338 4×Q6-0.319 6×Q7+0.411 8×Q8，F=0.364 84×Z1+0.296 30×Z2+0.187 97×Z3，将15批药材样品进行线性计算后，带入综合评价函数，计算综合得分值，分值越高，说明样品的综合品质越高。FF-3批样品的综合得分最高，综合质量最优。15批防风药材样品的综合得分情况见表9。根据因子负荷矩阵表，推测影响防风差异的并不是单一成分，而是多成分(群)协同作用的结果，峰2、峰4、峰7和峰8在主成分1上载荷绝对值最大；峰1、峰3、峰6、峰5和峰7在主成分2上的载荷绝对值最大；峰3、峰5和峰8在主成分3上的载荷量最大。见表10，图3。

图1 15批防风药材相似度评价谱图

图2 15批防风药材系统聚类

表8 15批防风药材主成分分析结果(%)

3 讨论

防风药材中含有多类不同的化学成分，影响防风药材质量的因素较多，仅根据单一化学指标进行定性定量分析评价药材质量，易产生片面性。多指标综合评价中评价指标权重分配不均又会导致评价对象优劣顺序的改变，因此权重的合理性、准确性直接影响评价结果的可靠性[15-17]。采用客观赋权评价方法对防风的浸出物、升麻素苷含量、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量3种指标性成分设置权重系数，避免主观因素造成的误差，能更全面、客观地评价防风药材质量。由实验结果可知，15批药材间浸出物、含量测定、灰分等质量指标存在一些差异，RSD值均大于5%，说明不同产地及不同生长环境对防风药材含量影响较大，结果显示15批药材中河南安阳产防风质量更优。

表9 15批药材防风药材指纹图谱综合得分值

表10 因子负荷矩阵

图3 载荷图

在指纹图谱分析方法建立过程中，为尽可能多地提取主要代表性成分，通过比较超声与回流2种提取方式，并考察纯水、甲醇和乙醇3种不同溶剂的提取效果，以及不同提取时间的提取效果，考察流动相、柱温、流速等因素的影响，以色谱图出峰个数、峰形、基线平稳性等为指标进行综合考察，结果显示，前处理方式为甲醇超声30 min时，可以尽可能多地提取主要成分，色谱条件选择1.0 mL/min流速、40 ℃柱温、254 nm以及甲醇-水的流动相时色谱图效果最佳。通过大量预实验来确保建立的指纹图谱共有模式具有代表性，通过对指纹图谱结果进行聚类及主成分研究分析[18-19]，可将15批药材大致分为2类，Ⅰ类为河南产防风，俗称水防风，Ⅱ类为河北、山西、内蒙古产防风，俗称北防风类，聚类分析结果说明产地对防风药材质量有一定的影响。通过对8个共有峰进行主成分分析，得到的3个主成分贡献率达84.911%，可基本代表原始数据的整体信息，根据载荷图发现8个共有峰对结果均有影响，说明影响防风质量的不是单一成分，而是多成分(群)协同作用的结果。

本研究将多指标综合评价与指纹图谱整体性评价2种评价方式相结合对不同产地的防风药材进行质量评价，结果显示2种评价方法得出的结论基本一致。2种评价方法相结合可以更加全面地评价药材质量，对建立更加全面、科学、合理的中药质量评价体系具有一定的参考意义。