多组学技术在葛根品质提升研究中的应用进展

胡心怡 吴田泽 侯 聪 郑雅芹 邓 港 刘 霞

(武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070)

葛根为豆科葛属植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，习称野葛。葛根性味甘、辛、凉，归脾、胃、肺经，具有解肌退热、生津止渴、解酒毒等诸多功效[1]，是一味常用的传统中药材，药用历史可以追溯到东汉时期的《神农本草经》。此外葛根中富含异黄酮，可用于降低血脂、血压、血糖，具有保健功能，是原卫生部首批发布的药食两用植物[2]。

近年来对于葛根的化学成分、药理药效等的研究已经具体深入，对于育种栽培以及分子生物学研究也逐年增多。本文将对葛根资源分布、质量控制、多组学研究、栽培育种和品质提升等方面的研究进展进行综述，对多组学研究在葛根品质提升方面的应用进行总结展望，以期推动对葛根的进一步开发利用。

1 葛根的资源与分布

全世界葛属植物35种，主要分布在温带和亚热带地区，中国有8种，在贵州有分布[3]。野葛和粉葛2种葛属植物常作药用，在《中华人民共和国药典》(2005版)之前并无区分，顾志平[4]在全国各地进行了实地调查，发现野葛在全国绝大多数地区均有分布，而粉葛则主要分布于广西和广东，人工栽培粉葛较为常见[4-5]。其调查到的我国葛属植物分布见表1。

表1 我国葛属植物分布

2 葛根的质量控制

2.1 化学成分 葛根的主要成分包括异黄酮类化合物和三萜类化合物，除此之外还富含生物碱类、皂苷类、香豆素类和多糖类化合物等多种化学成分[6]，还富含人体必需氨基酸、矿物质和微量元素等[7]。葛根的这些主要成分使其同时兼具药用和使用价值，因此对葛根的质量控制尤其重要。

2.2 药理学作用 葛根作为重要的药食同源中药材，其诸多有效成分能够发挥多种药理活性，如降低血压、抗脑梗死、抗动脉粥样硬化、抗心律失常、抗糖尿病、抗肿瘤、解热镇痛、抗氧化、抗阿尔茨海默病、抗帕金森症、抗抑郁、预防骨质疏松、保护肝脏、解酒等作用。见表2。

3 葛根的多组学研究

近年来，分子生物学技术发展迅速，随着高通量测序技术的出现，药用植物的基因组学、转录组学、代谢组学和蛋白质组学随之发展迅速，研究者们对于葛根的多组学研究也逐渐被报道。接下来将对近年来葛根的多组学研究进行总结。

3.1 葛根的基因组学研究 Zhang等[27]利用Illumina HiSeq X Ten测序获得了葛根叶绿体基因组，得到了全长153 411 bp的基因组，由一个84 131个碱基的大单拷贝区和一个17 990个碱基的短单拷贝区组成，中间隔着一对25 645个碱基的反向重复序列；叶绿体全基因组包含111个基因，其中77个为蛋白质编码基因、30个为tRNA基因，4个为rRNA基因；总GC含量为35.4%；系统发育分析表明，野葛与豆薯比较接近。

Cao等[28]对葛根的完整叶绿体基因组进行了组装，得到了全长153 442 bp的基因组，包含84 162个大的单拷贝区和17 998个小的单拷贝区，25 641个碱基的反向重复序列，GC含量为35.41%；叶绿体全基因组共编码129个基因，其中84个为蛋白质编码基因，37个为RNA基因，8个为rRNA基因。注释后的基因组序列提交GenBank，登录号为MT818508；此外还通过对豆科凤蝶亚科48种植物的系统发育树分析证明，葛根属于豆科蝶形花亚科，与豆薯(P.erosus)、赤豆(V.angularis)和菜豆(P.vulgaris)亲缘关系较近。

表2 葛根的药理作用

Sun等[29]也对葛根的叶绿体基因组测序，并利用这些数据对基因组资源进行了评估，得到叶绿体基因组全长共153 411个碱基，包含84 142个大的单拷贝区和17 998个小的单拷贝区；重新组装和注释表明，共编码112个基因，其中78个为蛋白质编码基因，30个为tRNA基因，4个为rRNA基因；总GC含量为35.4%。

3.2 葛根的转录组学研究 对葛根的转录组学研究始于2015年，近年来越来越多的研究者将目光投向葛根的转录组学研究。研究内容及结果总结见表3。

表3 葛根的转录组学研究

续表3 葛根的转录组学研究

3.3 葛根的代谢组学研究 Shang等[39]使用长阅读的单分子测序和Hi-C技术组装了高质量的葛根基因组。基因组大小为1.37 GB，由5 145个重叠群组成，重叠群N50为593.70 kb；基因组结构注释产生了869.33 Mb的重复区域，占基因组62.70%，编码蛋白质的基因45 270个；进化分析表明，葛根与大豆的亲缘关系最近，经历了2次古老的全基因组复制事件——一次是在豆科物种的共同祖先中，另一次是在大约720万年前物种形成后独立发生的；与其他5种豆科植物相比，葛根共有2 373个基因家族是独一无二的；还对与葛根素含量相关的基因和代谢产物进行了鉴定，共鉴定了572个在葛根素生物合成途径中上调的基因，235个候选基因通过组学数据进一步丰富；此外，还鉴定了6个与葛根素代谢密切相关的8-C-葡萄糖转移酶(8-C-GT)候选基因，填补了豆科植物基因组的一个重要空白，为葛根的遗传改良提供了有价值的多基因组资源。

Shang等[40]还进行了基于超高效液相色谱-串联质谱仪的广靶代谢组学分析，共鉴定了614种代谢物，其中包括初生代谢物和次生代谢物，不同品种积累特异代谢物；进行了主成分分析、聚类分析、KEGG富集分析来进行代谢组学分析，用Log2FC≥3和VIP≥1来进行营养成分分析，结果表明，葛根与其变种之间的营养差异可以用氨基酸、核苷酸、糖类和脂类丰度的差异来解释，而葛根与其变种之间药用品质差异则是由异黄酮类、异黄酮类、酚酸、有机酸和香豆素含量的差异造成的；此外，还确定了对3个葛根品种进行分类的关键代谢物。

3.4 葛根的蛋白组学研究 暂时未发现相关研究。

4 葛根的育种栽培

4.1 葛根的种植技术 葛根在中国的栽培历史悠久，最常见的葛属植物有常作药用的野葛和常做食用的粉葛。野葛在中国分布广，除新疆、西藏外其余各省皆有分布，而粉葛更是以栽培为主，因此出现了多个有“粉葛之乡”之称的粉葛种植地，葛根的栽培技术在实践中积累经验不断完善提升，从土地选择、精细整地、堆捂营养土、种藤选取、芽节扦插、防治病虫害等各个方面进行了具体而科学的规范，以达到高产高抗的种植目标[41]。

葛根喜温喜湿，大多生长在海拔1 600～2 100 m的背阴坡地，适宜生长温度为12～16 ℃。葛根于2月上旬开始萌芽，4～9月生长旺季，11月中旬生长减缓直至不再生长，在12月到次年2月之间为采收期，越冬率可达100%[42]。葛根耐寒耐干旱，对土壤的要求不高，因此在国内种植范围十分广阔。

4.2 葛根的新品种选育 近年来，人们对药食药膳、绿色食品等健康饮食的需求越来越高，对葛根的食品开发和育种栽培等的研究也逐渐增多；另一方面，国家对葛根的加工工艺和流程等制定了相关的标准，使食用葛根的质量和食品安全大大提高[43]。各研究所和药企也开始开展葛根新品种选育相关工作，虽然目前我国葛根新品种报道较少，选育进程缓慢，但也有了一定成效，选育出一系列优良葛根新品种，如湘葛系列、赣葛系列、宋葛系列、横峰系列、“恩葛-08”“桂葛1号”“桂粉葛1号”以及木生葛根、糯粉葛、菜粉葛和绿健葛根等[44-48]。

5 组学研究在品质提升方面的应用

葛根的有效成分绝大多数是它的次生代谢产物，代谢途径需要多种酶催化，找到合成有效成分的关键酶，就能了解在药材有效成分合成的分子机制和调控机制，进而利用基因工程技术对有效成分进行调控和生产。

5.1 药用有效成分葛根素 葛根素是葛根中最主要的药用活性成分，近年来对葛根素合成相关的研究逐渐增多，找到了一些与葛根素合成相关的基因、转录因子和酶等，在3.2中进行了详细论述。Wang等[31]对PlUGT43(一种葛根葡糖基转移酶)进行了分子克隆和功能鉴定，生化分析表明，PlUGT43具有大豆苷元C-糖基化为葛根素的活性，对异黄酮类大豆苷元和染料木素具有活性，但对包括黄酮类在内的其他潜在受体没有活性，证实了PlUGT43在葛根素生物合成中的作用。

5.2 膨大机制和淀粉合成 葛根作为重要的药食同源植物，富含淀粉、黄酮和葛根素等成分，除可作药用治疗多种疾病，其食用价值也很高。葛根除了可以作为蔬菜鲜食、炒菜、煲汤之外，最常见的是加工成为葛根粉，还可做成葛根面条、馒头、果糕、酒、茶、饮料等特色食品[2]。粉葛生长快、块茎大且富含淀粉，是人工种植最多的葛根品种，因此对葛根的膨大机制和淀粉合成相关基因的研究也不在少数。刘冬梅等[49]选取了普通葛根和块根膨大的野生型突变型葛根，运用cDNA-AFLP技术进行差异分析，分析结果筛选出5个特异表达片段，发现它们参与了信号转导、抗胁迫应答、电子传递和光合代谢等反应。郭丽君[50]为了提高葛根产量，克隆了淀粉合成关键酶腺苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose Pyrophosphorylase，AGPase)小亚基基因(sAGP)和大亚基基因(LAGP)，探究其对葛根块根长度、粗细、重量和产量的影响机制，发现AGPase基因表达变化是植物通过自身信号网络相互作用调控，进而调控淀粉合成关键酶活性变化，从而影响淀粉成分及含量变化。

5.3 抗逆 葛根喜爱湿润温暖的环境，干旱、低温等环境因素会对葛根的生长带来影响，因此可以利用温度、光照、水分等非生物胁迫或者病虫害等生物胁迫来筛选葛根相关的抗逆基因，为抗逆性强的葛根品种选育打下基础，以提高葛根的品质性状和产量性状。

6 展望

近年来，对葛根的分子研究逐渐增多，多组学研究特别是转录组学研究十分火热。研究者主要专注于葛根异黄酮类化合物合成相关的基因和代谢通路进行研究，获得了长足进展。然而，葛根的基因组学研究进展缓慢，蛋白质组学的研究更是尚未起步。因此，可以利用多组学联合技术，挖掘葛根素等有效成分生物合成相关的基因、调控蛋白、酶、转录因子以及次生代谢途径等，从而从分子层面对葛根分子研究的短板进行填补。

多组学研究可以从基因水平对葛根的品质提升进行指导，目前大部分研究针对的是葛根素合成相关的基因和酶，还有一部分研究专注于葛根膨大机制和淀粉合成，对于葛根抗逆方面的研究还有待提升。因此，可以利用温度、光照、水分等非生物胁迫或者病虫害等生物胁迫来筛选葛根相关的抗逆基因，从而提升葛根的抗逆性。

在葛根的种植和新品种选育方面，相对于常见的蔬菜水果等，葛根的品种选育进展较为缓慢，全国报道的葛根新品种不多，且推广种植面积较小。另外，最主要的药用成分葛根素在野葛中含量较高，在粉葛中含量较低，但是主要选育和种植的葛根绝大部分为淀粉含量高、食用价值高的粉葛，其葛根素含量很难达到药典规定的标准。因此，对于富含药用有效成分葛根素的野葛的新品种选育有待加强。