CD41+血小板微粒在不同血压昼夜节律高血压病患者的变化

范景如 张苏伟 赵传伟 王晓莉 陈子清 林振素 郭舜奇

（汕头市中心医院，广东 汕头 515041）

微粒（Microparticle，MP）是从细胞膜出芽式产生的直径约0.4-1μm 小囊泡，表面携带大量受体，内含有蛋白、mRNA、microRNA 等。血循环中白细胞、内皮细胞、血小板等均可产生微粒，最多是血小板微粒（Platelet Microparticle，PMP），参与了血液中炎症、免疫反应、血管生成等病理生理过程[1]。血管内皮细胞是维持血管稳定重要部分，动脉硬化的始动环节是内皮细胞损伤与功能失调，而高血压导致心、脑、肾的损伤的病理生理过程均有动脉硬化，基于血压所致动脉硬化早期为血管内皮损伤，从而处于易形成血栓的状态，从而促进血小板产生更多的PMP，而PMP 促凝血活性是50-100 倍于血小板，加剧发生血栓事件；另PMP 强烈的促凝作用、传递生物因子并参与免疫炎症反应。已有研究证实PMP 在急性冠脉综合患者高于稳定性心绞痛，而后者高于健康人[2]，有研究发现在重度高血压升高，且PMP 水平与血压严重程度呈正相关，提示PMP 在高血压疾病发生发展中有重要地位，是高血压相关血栓事件的重要预测指标[3]。人体存在血压昼夜节律（Blood Pressure Circadian Rhythm，BPCR），它是通过 24h 动态血压监测（Ambulatory Blood-pressure Monitoring，ABPM）检测的，可更全面地反映一天血压的整体变化情况及变异性。并被多个指南推荐为评价高血压患者降压达标的重要检查手段，所测量的结果作为高血压诊治及评估预后的重要依据[4-6]。BPCR 消失是高血压对血栓性事件等急性心脑血管事件甚至死亡存在独立预测价值[7,8]。PMP 与血栓事件密切相关，本文指通过研究高血压患者不同昼夜节律患者血循环中PMP 的变化，探讨PMP 与高血压患者BPCR消失的相关性。为高血压病相关血栓性事件研究提供初步理论探索，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

入组2018年3月至2020年9月期间于我院高血压门诊并住院的高血压患者，年龄在30-75 岁。按照《中国高血压防治指南2018》高血压诊断标准收录患者：收缩压≥140mmHg 和/或舒张压≥90mmHg；且尚未服降压药或至少入组前2 周内未服过任何降压药[6]；住院后完成ABPM 检查。排除标准：肺动脉高压、糖尿病、脑血管意外或心肌病、严重心律失常、严重心力衰竭、严重的心脏瓣膜疾病、急性心肌梗死等心血管疾病、近期急性或慢性炎症或手术史、恶性肿瘤或自身免疫性疾病、外周血管疾病或严重呼吸系统疾病、严重的肝、肾功能不全或甲状腺功能异常、存在嗜酒、睡眠倒错者、服用抗生素、抗血小板药或调脂药者。本研究经过本院伦理委员会审核通过（审批号：2019-科研（073）号），所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方 法

1.2.1 一般资料收集 记录入组者的性别、年龄、身高、体重、吸烟史、酗酒史、高血压病程，既往病史、过敏史、手术史、及药物使用情况，第二天清晨7 时空腹抽静脉血。送医院检测，同时留取外周血3mL/例。

1.2.2 动态血压检查 ABPM 仪器采用无创型携带动态血压检测仪（美国SunTech 医疗公司，Oscar 2系列动态血压仪）。记录血压相关参数。

1.2.3 动态血压诊断高血压的标准和分级标准 动态血压诊断高血压的标准：动态血压白天平均值≥135/85mmHg，或 24h 平均值≥130/80mmHg，或夜间平均值≥120/70mmHg。以24h 血压平均值标准进行分级：1 级高血压：130/80-145/90mmHg；2 级高血压 ：145/90 -160/100mmHg；3 级 高 血 压 >160/100mmHg。如果收缩压与舒张压出现不同结果，以高一级为最终分级[6,9,10]；另部分诊室血压初步诊断为高血压，动态血压检查又未达到以动态血压诊断标准的患者，列入白大衣高血压组。

1.2.4 高血压病患者昼夜节律模式分组标准 动态血压昼夜节律（NBPDR）=（白天平均血压-夜间平均血压）/白天血压平均值×100%。正常NBPDR 通常为10%-20%，高血压患者部分血压节律消失，即≤10%；NBPDR≤0%为反杓型，≥20%为超杓型，据我院既往数据统计，这两类患者所占数量太少，反杓型归入非杓型组，超杓型归入杓型组，为据此我们分为：非杓型组（0%-10%，≤0%）、杓型组（10%-20%，≥20%）[6,9,10]。

1.2.5 血浆PMP 水平的检测 （1）采集入组者3mL外周血，4h 内提取血小板贫瘠血浆：于室温下1500g离心10min，去除血细胞，获得富含血小板血浆，移1.5mL 入 EP 管中，然后 13000g, 4℃，离心 10min，去除血小板，获得贫瘠血小板血浆，保存于1.5mL LEP管中，-20℃保存；（2）样本足够后，取出后一次性冻融后（一次冻融不影PMP 的测定），从每样本中取50μL，加入 20μL 特异性荧光抗体（anti-CD41-FITC）。另取50μL 加入同等数量的同型抗体（IgG1-FITC），室温下避光孵育 30min；（3）取直径为 1.0μm的2-氨基乙基化聚苯乙烯微球，溶于1mL 的双蒸水中，在振荡器上混匀后，作为内参来确定所要检测内皮微粒的大小；（4）孵育30min 后，各管加入1mL的鞘液，后上流式细胞仪（Beckman Coulter epics XL，单激光四色，美国）测定：前向角FS 及侧向角SS取对数Log 放大，1.0μm 的标准微球位于FS/SS 散点图右上方（见图1），固在散点图中集中区域左下侧圈门来确定微泡的大小（均≤1.0μm），然后进行特异性荧光抗体表达分析，两色法定义：PMP<1.0μm 且CD41+，根据绝对计数微球的浓度换算得出血浆中PMP 浓度。

图1 流式细胞图

1.3 观察指标

（1）一般资料：性别、年龄、体质量指数（BMI）、低密度胆固醇胆固醇（LDL-C）、糖化血红蛋白（HbA1C）、 C 反应蛋白（CRP）、同型半胱氨酸（HCY）及尿酸（UA）。

（2）动态血压检查参数：24h 平均动脉压（24 hour mean arterial Blood pressure,24hMABP）、24h 平均脉压差（24 hour mean pulse pressure,24hMPP）、24h 平均收缩压（24 hour Mean Systolic Blood Pressure,24hMSBP）、24h 平均舒张压（24 hour Mean Diastolic Blood Pressure,24hMDBP）、白天平均收缩压（Daytime Mean Systolic Blood Pressure,dMSBP）、白天平均舒张压（Daytime Mean Diastolic Blood Pressure,dMDBP）、夜间平均收缩压（Nighttime Mean Systolic Blood Pressure,nMSBP）、夜间平均舒 张 压 （Nighttime Mean Diastolic Blood Pressure, nMDBP）、夜间血压下降率(nighttime blood pressure decrease rate,NBPDR)=（白天血压平均值-夜间血压平均值）/白天血压平均值×100%。

（3）血浆 PMP 的浓度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 对数据进行统计学分析。定量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验, 多组间均数比较方差齐时采用单因素方差分析，方差不齐采用非参数检验，并利用Tukey HSD 事后多重比较进行两两比较。定性资料用频率表示，组间比较采用卡方检验。相关性分析采用秩相关进行相关性分析，回归分析采用线性回归分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病例收集基本情况

本研究共232例，其中有24例为白大衣高血压组。其余符合高血压诊断标准且暂未治疗的患者共208例，其中男 97例（46.6%），女性 111例（53.4%）（女性中：绝经前 28例、绝经后 83例）；吸烟 76例（36.5%），无吸烟 132例（63.4%）；平均年龄（56.0±10.9）岁，年龄最小31 岁，最大75 岁。按动态血压分级标准：高血压 1 级 101例，2 级 45例，3 级 62例。白大衣性高血压、高血压1、2、3 级组患者一般资料及动态血压参数见表1。一般资料中4 组间除年龄、LDL-C 差异有统计学意义外，其余指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。动态血压参数中4 组间均存在统计学差异（P<0.05）。

存在统计学差异的各项目中，再进行两两比较中：在年龄中：1 级组高于余各组；在 LDL-C 中：3 级组低于1 级组或2 级组；在动态血压参数中：白大衣高血压组与1 级组中的24h 舒张压、白天舒张压、夜间舒张压不存在统计学差异；NBPDR3 级组低于白大衣或1 级组（见表1）。

表1 白大衣高血压及不同高血压级别一般情况及动态血压参数的比较

2.2 不同级别高血压分级的PMP 水平比较

2.2.1 以动态血压作为高血压的分级标准 白大衣高血压组、1 级高血压组、2 级高血压组、3 级高血压组 PMP 水平分别为（1657.14±461.36）、（2087.93±669.18）、（2361.54 ±1131.03）、（2888.89 ±740.34）个/μL。存在组间差异（F=32.796，P<0.001）,进行两两比较中：2 级高血压组PMP 水平与1 级高血压组不存在统计学差异，余各组的两两比较差异均存在统计学差异（P<0.05），见表2。

表2 不同高血压级别PMP 水平（个/μL）及比较

2.2.2 以诊室血压作为高血压的分级标准 1 级高血压组、2 级高血压组、3 级高血压组PMP 平均水平分别为（n=135，2075.71±723.79）、（n=70，2816.67±962.38）、（n=27，2387.50±866.94）个/μL。仅 2 级高血压组PMP 水平高于1 级高血压组，余各组的两两比较差异均不存在统计学差异（P<0.05）。

2.3 高血压患者不同血压昼夜节律模式分组的PMP 比较

高血压患者血压杓型组与非杓型组的糖化血红蛋白、夜间平均收缩压、NBPDR 差异有统计学意义（P<0.05）。非杓型组PMP 水平高于杓型组，见表3。

表3 高血压病患者血压杓型组与非杓型组的基本资料及PMP 的比较

2.4 不同高血压分级、不同血压昼夜模式患者PMP 的比较

在动态高血压分级后，再不同血压昼夜模式的比较，不同级别高血压患者的PMP 水平（个/μL）在血压杓型组与非杓型组均存在统计学差异，见表4。

表4 不同级别高血压病患者血压杓型组与非杓型组的PMP 水平的比较

2.5 相关性和回归分析

通过相关性分析发现，高血压患者NBPDR 与PMP 水平（个/μL）均存在负相关性（r=-0.661，P<0.001）。在线性回归的的模型建立中，PMP 为因变量，性别、年龄、BMI、TG、LDL-C、HbA1C、CRP、UA、HCY、OSBP、ODBP、24hMABP、24hMPP、24hMSBP、24hMDBP、dMSBP、dMDBP、nMSBP、nMDBP、NBPDR为自变量。建立的标准化线性回归方程为：PMP=0.176BMI+0.382OSBP-0.646NBPDR。这说明OSBP、BMI 及NBPDR 是高血压患者PMP 水平的影响因素，其中NBPDR 的影响程度最大。

3 讨 论

Wolf P 等于 1967年发现了 PMP 的存在，James E. Rothman 等三位科学家发现其运行及调节的机制，并因此获得了诺贝尔奖，PMP 释放量与血压升高的剪切应力持续激活血小板持续的时间成正比[11]，在血管内皮损伤方面，有动物研究报道大鼠血循环中的PMP 水平升高与内皮细胞中的一氧化氮水平成反比，进而增加了内皮通透性[12]，加速了脂质沉积于内皮细胞的速度；另有研究发现PMP 进入内皮细胞后，导致了白介素6 及肿瘤坏死因子等炎症因子及细胞间黏附分子、活性氧水平升高，并提示PMP 导致内皮损伤的途径存在线粒体凋亡机制[13]。

在PMP 另参与了动脉硬化的炎症反应，其所含的血小板炎症因子P 选择素、趋化因子，具有促进白细胞及单核细胞黏附于内皮下，加剧炎症反应，同时能使硬化斑块中的平滑肌细胞从梭形向菱形转化，减弱收缩性能，说明PMP 导致了平滑肌细胞的炎性表型的变异，加速了动脉硬化。另有动物研究发现PMP 中的主要脂质为溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC），后者与动脉硬化的斑块不稳定直接相关，并提示血浆PMP 可作为斑块不稳定的血液学标志，也提示PMP 与高血压患者相关血栓事件风险密切相关[14,15]，有新近研究提示PMP传递miR-126-3P 进入巨噬细胞从而增强其吞噬脂质的能力加重动脉硬化[16]。有动物高血压的研究提示PMP 通过递送miR-142-3p 进入血管内皮细胞，加速了血管内皮细胞的调亡[17]，这些研究均提示PMP 的升高加剧了血管内皮损伤、动脉硬化，血栓风险增加，而本研究中3 级高血压病患者的CD41+PMP 明显升高，可能提示其实动脉硬化程度严重，且CD41+PMP 可能参与了高血压的动脉硬化。

血压昼夜节律消失即为非杓型血压或夜间高血压，有调查显示高血压患者中约52%的节律消失，这一比例与本研究的结果相近[18]。夜间睡眠占24h节律的约三分之一时间，这时血压也随之下降，是人体心、脑、肾等重要器官恢复和血管内皮修复的重要时间段，这时如果血压异常升高，对血管的侧压强异常增加，损伤血管，引发或加重动脉硬化，且会造成心、脑、肾等重要器官在夜间仍处于超负荷运转中，最终首先导致了这些靶器官的损害，长期持续存在时导致进行加重的器官损伤[19]。持续的夜间高血压是一个更加“隐匿的杀手”，更提示高血压的严重程度，对其发生心脑血管事件的独立预测价值[7,8]。这说明非杓型高血压患者心脑血管事件发生率上升，而已有多个研究报道了血浆PMP 水平与动脉硬化严重程度严重相关[2,3]。其中，也有另外研究利用不同PMP 的不同表型（如 CD31+/CD42b+或 CD62P），发现CD62P 的血小板微粒在高血压患者中明显升高[3,20]。国内有报道了CD31+/CD42b+的PMP 在高血压患者是中伴肥胖症者明显高于不肥胖者，并与血HDL-C存在密切相关，提示PMP 可能是高血压伴肥胖的标记物[21]。Alexandru N 等报道了血浆PMP 在高胆固醇的高血压患者升高，并提示其机制可能是这类患者动脉硬化的重要机制之一[22]。本研究中的结果中，诊室血压、体重指数及夜间血压下降率是预测高血压病患者PMP（CD41+）水平的独立预测因子，说明三者与PMP 存在相关，与上面研究结果一致。另发现NBPDR 的预测强度最大。说明PMP 可能也是夜间高血压所致动脉硬化的重要的发病机制之一。在PMP 的生物学作用中，除了同样有大量粘附分子和生物学作用外，其和血小板直接进入动脉的中层弹性结构后，在动脉硬化中和脂质、复合糖类一同积聚，形成微小血栓形或微出血灶，导致了血管内皮系统中舒张血管、抗血栓形成、相关抗病原等特性的减弱，进而介导表层纤维组织增生及钙质沉积，使纤维帽形成，动脉弹性层逐渐钙化而血管失去弹性。

综上所述，降压达标同时应该维持血压昼夜节律，达到真正的降压达标。另高血压患者的动脉硬化的一预防治疗即抗血小板的治疗的起动时机是目前常用的以10年心血管风险评分作为标准[6]。目前有多个基础及临床研究提示抗血小板药物可降低PMP 的水平[23-24]，更有研究提示PMP 能预测脑卒中的发生[25]。更说明PMP 为高血压患者动脉硬化进程的重要参与者，可能是预测高血压患者的严重程度，特别是血栓形成风险的一个重要预测指标，或可作为高血压患者起用抗血小板治疗时机及评价治疗效果的潜在标记物。结合本研究结果，3 级高血压及非杓型高血压患者的PMP 水平更应得到注意，以降低其血浆PMP 水平作为降压综合治疗的其中一个靶点。因此探讨PMP 在高血压的严重程度评估、抗血小板治疗及预防血栓形成的作用具有积极的意义，能做到更好、更全面地防治高血压，保护心、脑、肾等靶器官，更早预防严重血栓事件的发生。