WIP1基因对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响及其在小鼠不同生长阶段的表达

王 楠，冯保亮，郑云曦，黄 雷，王 悦，徐松松，，张秀玲，刘志国，李 奎，，牟玉莲

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.天津市宁河原种猪场有限责任公司，天津 301504；3.南昌大学玛丽女王学院，南昌 330031；4.中国农业科学院农业基因组研究所，深圳 518120)

脂肪组织是一类疏松结缔组织，具有贮存能量、产热以及保护生物体内器官等作用。脂肪组织的形成主要是脂肪细胞体积以及数量增加的结果，脂肪细胞生成主要包括脂肪组织中的间充质干细胞增殖分化形成前脂肪细胞、前脂肪细胞通过终末定向分化最终形成成熟的脂肪细胞2个阶段[1]。脂肪细胞分化是一个高度有序的过程，受到相关激素、转录因子、基因和信号通路的调控[2]。在脂肪细胞分化阶段，CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)转录因子家族以及过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)[3-4]在脂滴形成中起关键作用[5]，尤其是PPARγ处于脂肪细胞分化转录调控网络的中心位置。长亚型核转录因子红系2相关因子1(L-NRF1)是脂肪生成的关键负调节因子，L-NRF1基因敲低可通过上调PPARγ的表达增强3T3-L1前脂肪细胞的成脂能力，L-NRF1-741的过表达可通过下调PPARγ的表达显著减弱3T3-L1细胞的脂肪生成潜能[6]。沉默中介复合物亚基19(MED19)也可以通过介导PPARγ基因调控脂肪生成[7]。Zhu等[8]研究表明，溶质载体蛋白家族25成员5(SLC25A5)可以调控脂肪分化，SLC25A5的缺失可抑制C/EBPα、PPARγ等脂肪生成相关因子的表达，减少甘油三酯的积累。解偶联蛋白1(UCP1)也可调控脂肪细胞分化，减少动物脂肪沉积[9-10]。虽然国内外学者已经发现一些与脂肪生成性状相关的候选基因，并明确了其与转录因子的相互关系。然而，当前影响脂肪生成的基因鉴定仍存在不足，调控机理的解析仍有待深入。因此，挖掘与脂肪生成相关的候选基因并阐明其调控机制一直是研究的热点。

野生型p53诱导磷酸酶1(WIP1)是一种丝/苏氨酸磷酸酶，由蛋白磷酸化酶Mg2+/Mn2+依赖性1D(PPM1D)基因编码[11]，属于2C家族蛋白磷酸化酶(PP2C)家族成员[12]，分别位于人的17号染色体[13]、小鼠的11号染色体[11]、猪的12号染色体。人、猪、牛、羊WIP1蛋白均由605个氨基酸组成，小鼠WIP1蛋白由598个氨基酸组成，这5个物种WIP1蛋白序列相似度高达81%，表明其在哺乳动物中高度保守。WIP1基因在动物体内广泛表达，是各种生物过程中的重要调控因子，如在细胞增殖、衰老、凋亡、自噬、DNA损伤修复、免疫调节、肿瘤发生和动脉粥样硬化疾病等生理和病理过程中发挥着功能[14-21]。随着研究的不断深入，WIP1基因与脂肪的关系越来越受到关注。WIP1基因过表达的人间充质干细胞能够表达脂肪生成特异性标记，而野生型细胞不表达，提示WIP1基因可能具有调控脂肪生成的能力[22]。Le Guezennec等[23]报道WIP1基因在脂肪聚集中发挥着重要的作用，其可促进小鼠体重的增长和脂肪的累积。随后，Armata等[24]报道在高脂饲喂条件下，与对照组相比，WIP1基因敲除小鼠可以阻止高脂诱导的肥胖、食物消耗水平降低和瘦素水平降低。Li等[25]发现WIP1基因敲除小鼠胎儿成纤维细胞成脂分化能力严重下降，PPARγ等脂肪生成相关关键基因的表达量下调。表明WIP1可能是一个新的调控脂肪生成的基因，但与脂肪生成的关系及其分子调控机制仍需要深入探究。

3T3-L1前脂肪细胞是体外研究脂肪生成机制的良好模型，可揭示脂肪细胞分化的分子过程。3T3-L1细胞系向成熟的脂肪细胞分化的过程主要包括细胞周期停滞、定向诱导分化、有丝分裂克隆增殖以及形成成熟脂肪细胞的终末分化等阶段[26]。本研究以3T3-L1前脂肪细胞为材料，构建WIP1基因敲低细胞模型，在体外探究WIP1基因对脂肪细胞增殖及成脂分化的潜在调控作用，并在小鼠个体水平验证其与脂肪沉积的相关性，为深入研究WIP1基因调控脂肪沉积的分子机制积累基础研究数据，以期为家畜选育提供新的基因素材。

1 材料与方法

1.1 细胞和试验动物

3T3-L1前脂肪细胞(第15代)由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物基因工程与种质创新团队保存；不同生长阶段(21日龄、8周龄和6月龄)的SPF级C57BL/6J雄性小鼠各10只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所SPF级鼠房统一饲养管理。

1.2 主要试剂

DMEM高糖培养基(SH30243.01)购自HyClone公司；胎牛血清(10099-141)、青-链霉素(15140-122)和0.25%胰酶(25200072)均购自Gibco公司；Lipofectamine RNAiMAX(13778-075)和Opti-MEM(31985-070)购自Invitrogen公司；CCK-8(CK04)购自Dojindo公司；胰岛素(I2643)、地塞米松(D1756)、异丁基甲基黄嘌呤(I5879)和罗格列酮(R2408)均购自Sigma公司；甘油三酯酶法测定试剂盒(E1013-105)购自北京普利莱基因技术有限公司；β-actin抗体(4970S)和PPARγ抗体(2443S)购自Cell Signaling Technology公司；WIP1抗体(ab31270)购自Abcam公司；RNAiso Plus(9109)、反转录试剂盒(RR047A)和SYBR荧光定量试剂盒(RR820A)均购自TaKaRa公司；油红O染色液(G1260)购自北京索莱宝科技有限公司；细胞裂解液(778501)、蛋白酶和磷酸酶抑制剂(A32959)均购自Thermo公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)购自Beyotime公司；上样缓冲液(CW0027S)购自CWBIO公司；脱脂奶粉(232100)购自Becton Dickinson公司；NC膜(HATF00010)购自Millipore公司。

1.3 siRNA筛选

1.3.1 siRNA设计及合成 根据GenBank中小鼠WIP1基因mRNA序列(登录号：NM_016910.3)，分别针对碱基位点790、893和1 845附近区域设计3对WIP1-siRNAs(WIP1-790、WIP1-893、WIP1-1845)，以非特异性片段为阴性对照(NC-siRNA),并委托上海吉玛制药技术有限公司进行序列合成，序列信息见表1。

表1 WIP1基因siRNA序列

1.3.2 细胞培养与转染 3T3-L1前脂肪细胞(第17代)以2×105/孔铺板于12孔板中，培养于含有10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM高糖培养基中。在37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h后进行siRNA的转染(细胞生长密度达到70%～80%)。细胞转染试剂为Lipofectamine RNAiMAX，参照试剂说明书转染体系和操作流程将WIP1-siRNAs和NC-siRNA分别转染细胞。转染体系配制如下：用Opti-MEM培养液将3 μL Lpofectamine RNAiMAX配制成50 μL的预混液1；然后取0.5 μL siRNA用Opti-MEM稀释为50 μL的预混液2，将预混液1和预混液2混合后配制为完整的转染体系，于室温下避光孵育20 min。将100 μL转染体系逐滴加入预先加入培养液的单个细胞培养孔中，每组设置3个复孔。细胞转染24 h后换成预热的新鲜完全培养基，并于转染后48 h收集细胞样品进行后续试验。

1.3.3WIP1基因siRNA干扰效率检测 利用Trizol方法提取1.3.2收集细胞的RNA，并反转录合成cDNA。根据GenBank中WIP1、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和CyclinB1、PPARγ、C/EBPα、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)和β-actin基因mRNA序列，利用Primer-BLAST工具设计实时荧光定量PCR引物，引物信息见表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实时荧光定量PCR反应体系20 μL：TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus) (2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。根据WIP1-siRNAs组和NC-siRNA组WIP1基因表达情况，选取干扰效果最佳的WIP1-siRNA开展后续的细胞功能试验。

表2 引物信息

1.4 干扰WIP1基因对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

1.4.1 CCK-8检测细胞增殖 将3T3-L1前脂肪细胞(第17代)铺至96孔板中，接种密度为5.6×104/cm2；培养24 h后分别转染WIP1-siRNA和NC-siRNA，每个转染组设置0、12、24、48、72、96和120 h 7个检测时间点，每个时间点设置5个重复。按照CCK-8试剂盒说明书进行细胞增殖情况检测。利用酶标仪检测D450 nm值，比较不同转染组相应时间点D450 nm值差异。

1.4.2 细胞周期基因表达检测 将3T3-L1前脂肪细胞(第17代)以5.6×104/cm2铺于12孔板中，分别转染WIP1-siRNA和NC-siRNA，每个转染组设置3个重复。分别收集转染24和48 h后的细胞样品，进行脂肪细胞总RNA的提取，并反转录为cDNA，以β-actin为内参基因，按照1.3.3的方法检测细胞周期基因的表达。

1.5 干扰WIP1基因对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响

1.5.1 3T3-L1前脂肪细胞成脂诱导分化 将3T3-L1前脂肪细胞(第17代)分别转染WIP1-siRNA和NC-siRNA，每个转染组设置3个复孔，细胞转染48 h后更换诱导培养基(DMEM高糖培养基+5 μg/mL胰岛素+0.4 μg/mL地塞米松+0.5 mol/L异丁基甲基黄嘌呤+1 μmol/L罗格列酮+10%胎牛血清+1%青-链霉素)开始成脂诱导分化。诱导培养基处理2 d(分化第2天)后将其换成维持培养基(DMEM高糖培养基+5 μg/mL胰岛素+10%胎牛血清+1%青-链霉素)，继续在培养箱中培养2 d(分化第4天)，然后更换为DMEM完全培养基(DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+1%青-链霉素)。之后每2 d更换1次DMEM完全培养基。

1.5.2 脂肪细胞油红O染色 收集WIP1-siRNA和NC-siRNA组成脂诱导8 d的细胞，按照油红O染色试剂盒的说明进行染色。染色后的细胞置于倒置显微镜下观察并拍照。每孔细胞加入1 mL异丙醇，置于37 ℃培养箱孵育10 min，萃取油红O染液，并用分光光度计检测D510 nm值。

1.5.3 脂肪细胞甘油三酯检测 收集WIP1-siRNA和NC-siRNA组成脂诱导分化8 d的细胞样品，按照甘油三酯酶测定试剂盒说明检测各组细胞甘油三酯含量。

1.5.4 成脂分化标志基因mRNA表达量的检测 收集WIP1-siRNA和NC-siRNA组诱导分化8 d的细胞，分别提取RNA并反转录合成cDNA，以β-actin为内参基因，按照1.3.3的方法检测PPARγ、C/EBPα、FABP4、SCD1基因的表达情况。

1.5.5 WIP1、PPARγ蛋白表达量的检测 在WIP1-siRNA和NC-siRNA组诱导分化8 d的细胞培养孔中每孔加入120 μL配置好的蛋白裂解液(10 mL细胞裂解液中加入50 mg蛋白酶和磷酸酶抑制剂)冰上裂解30 min。细胞裂解物4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液，并用BCA法检测蛋白浓度。各取20 μg蛋白于上样缓冲液中100 ℃热变性10 min，使用10% SDS-PAGE电泳凝胶进行蛋白的分离，然后转移到NC膜上。转膜完成后，用5%脱脂奶粉封闭1 h，分别孵育WIP1(1∶1 000)、PPARγ(1∶2 000)蛋白的一抗以及对应的二抗(1∶2 000)，孵育完成后在Tanon化学发光仪中观察并拍照，使用ImageJ 1.48软件统计灰度值。

1.6 WIP1基因在小鼠不同生长阶段脂肪组织中的表达量检测

分别采集21日龄、8周龄和6月龄小鼠各10只的腹股沟皮下脂肪组织(ingWAT)和性腺脂肪组织(pgWAT)，用Trizol方法提取组织RNA并反转录合成cDNA。以β-actin为内参基因，按照1.3.3的方法检测腹股沟皮下脂肪组织和性腺脂肪组织中WIP1基因的表达情况。

1.7 数据统计分析

利用GraphPad Prism 8.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，Tukey法进行组间多重比较。结果以平均值±标准误表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 siRNA筛选

由图1可知，与NC-siRNA组相比，3对siRNAs组WIP1基因的表达量均极显著降低(P<0.01)，其中WIP1-790与WIP1-1845的干扰效率可达70%以上，WIP1-893的干扰效率在50%以上。因此后续细胞试验选用干扰效率最高的WIP1-790。

2.2 干扰WIP1基因对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

CCK-8检测结果显示，WIP1-790干扰组细胞的增殖速率在指数增长期(24、48和72 h)、平台期(96 h)和退化衰亡期(120 h)均极显著低于NC-siRNA组细胞(P<0.01)(图2A)。实时荧光定量PCR结果显示，WIP1-790干扰组细胞在干扰后24和48 h，CyclinD1和CyclinB1基因mRNA水平均极显著低于NC-siRNA组细胞(P<0.01)(图2B)。

肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。图6同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as fig.6图1 WIP1-siRNAs干扰效率的检测Fig.1 Detection of WIP1-siRNAs interference efficiency

2.3 干扰WIP1基因对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响

2.3.1 干扰WIP1基因对脂质积聚的影响 油红O染色结果显示，WIP1-790干扰组细胞在分化第8天的油红O染色阳性细胞(脂肪细胞)明显少于NC-siRNA组(图3A)。脂滴和甘油三酯的定量检测结果显示，与NC-siRNA组相比，WIP1-790干扰组细胞的脂滴数量极显著降低(P<0.01)，甘油三酯含量显著降低(P<0.05)(图3B、3C)。

2.3.2 干扰WIP1基因对成脂分化标志基因mRNA表达的影响 实时荧光定量PCR检测结果表明，与NC-siRNA组细胞相比，WIP1-790干扰组细胞的成脂分化相关基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、SCD1的mRNA在分化第8天的表达水平均极显著降低(P<0.01)(图4)。

2.3.3 干扰WIP1基因对成脂分化因子PPARγ蛋白表达量的影响 Western blotting结果显示，与NC-siRNA组相比，WIP1-790干扰组细胞WIP1蛋白表达量显著下降(P<0.05)；PPARγ蛋白表达水平极显著下降(P<0.01)(图5)。

①A，CCK-8增殖曲线；B，转染后24和48 h Cyclin D1和Cyclin B1基因表达情况。②与NC-siRNA组相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)；无*，差异不显著(P>0.05)。下同①A,CCK-8 proliferation curve;B,The relative expression of Cyclin D1和Cyclin B1 genes at 24 and 48 h after transfection.②Compared with NC-siRNA group,*,Significant difference(P<0.05)；**，Extremely significant difference(P<0.01)；No *,No significant difference(P>0.05).The same as below图2 干扰WIP1基因对细胞增殖的影响Fig.2 Effect of WIP1 gene interference on cell proliferation

A，油红O染色(200×)；B，分化第8天异丙醇萃取油红O分光光度检测；C，分化第8天细胞中甘油三酯含量检测A,Oil red O staining (200×);B,Spectrophotometric detection of oil red O extracted with isopropanol on the eighth day of differentiation;C,Detection of triglyceride content in cells on the eighth day of differentiation图3 干扰WIP1基因对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响Fig.3 Effects of WIP1 gene interference on adipogenic differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

图4 成脂分化相关基因mRNA水平的检测Fig.4 Detection of mRNA level of genes related to adipogenic differentiation

图5 Western blotting检测WIP1、PPARγ蛋白表达量Fig.5 WIP1 and PPARγ protein expression detected by Western blotting

2.4 WIP1基因在不同生长阶段小鼠脂肪组织中的表达检测

不同生长阶段(21日龄、8周龄和6月龄)C57BL/6J小鼠的ingWAT和pgWAT中WIP1基因实时荧光定量PCR检测结果显示，在ingWAT中8周龄小鼠WIP1基因表达量显著高于21日龄小鼠(P<0.05)，6月龄小鼠极显著高于8周龄(P<0.01)(图6A)。在pgWAT中，8周龄小鼠WIP1基因表达量与21日龄小鼠无显著差异(P>0.05)，而6月龄小鼠极显著高于8周龄和21日龄小鼠(P<0.01)(图6B)。

图6 WIP1基因在小鼠不同生长阶段腹股沟皮下脂肪组织(A)和性腺脂肪组织(B)中的表达情况Fig.6 The expression of WIP1 gene in ingWAT (A) and pgWAT (B) of mice at different growth stages

3 讨 论

WIP1基因广泛表达于全身各组织器官，作为一种蛋白磷酸酶参与不同信号通路的调控，在各靶器官中表现为特异的生物学功能，是一个典型的一因多效基因。WIP1基因的功能研究主要集中在免疫系统调节[18]和癌症发生等方面[27]。近年来，WIP1基因在脂肪沉积[23]、神经发生[28-29]、生殖发育[30]等方面的作用逐步被发现和了解。WIP1基因的体外研究显示，其在间充质干细胞中的过表达能够促进脂肪生成相关特异性标志基因的表达，揭示其参与脂肪生成调控的潜在作用[22]。为了探究WIP1基因与3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的关系，本研究筛选到干扰效果良好的WIP1-siRNA，并以WIP1基因敲减的3T3-L1前脂肪细胞为模型，进行了细胞增殖速率和分化能力的检测。本研究结果发现，WIP1基因敲减细胞的增殖和分化能力均显著下降，证实了WIP1基因可调控脂肪细胞的分化。WIP1基因敲减后脂肪细胞CyclinB1、CyclinD1和PPARγ等基因的表达量也显著下调，表明WIP1基因可能通过调节细胞周期基因的表达水平来促进细胞的增殖，并通过调节成脂分化相关基因的表达参与3T3-L1前脂肪细胞成脂分化能力的调节。

在细胞增殖调控方面，已有研究发现，WIP1基因敲除后，神经前体细胞[28]和支持细胞[30]的增殖受到抑制，其机制是转型相关蛋白53(p53)活性下降导致细胞周期的G2期阻滞，CyclinB1基因参与细胞周期G2至M期转换[31]。本研究发现，CyclinB1基因表达量在WIP1基因干扰细胞中显著下降，且细胞增殖速率降低，WIP1基因是否可能通过p53-Cyclin B1途径调控前脂肪细胞的增殖有待探讨。本研究中WIP1基因敲减后CyclinD1基因表达量降低，而CyclinD1基因对细胞周期G1期的调控具有重要作用[31]，暗示了WIP1基因也可能通过其他途径参与了细胞周期G1期的调控。WIP1基因在前脂肪细胞增殖调控过程中的直接靶点及其分子调控机制还有待进一步研究。另外，WIP1基因敲除的间充质干细胞也发生了细胞周期G2期阻滞[32]，WIP1基因表达量下调引起的细胞周期阻滞将导致成体干细胞如成纤维细胞[16]和骨髓间充质干细胞[32]的早衰。3T3-L1前脂肪细胞是成体干细胞的一种，WIP1基因是否影响前脂肪细胞周期的阻滞、早衰进而调控增殖也是需要探讨的问题。在细胞分化调控方面，近期研究发现，WIP1基因对分化的调控具有细胞特异性。如Ogasawara等[33]研究表明，WIP1基因通过对维甲酸-细胞外信号调节激酶(RA-Erk)信号通路的调控来抑制畸胎瘤细胞的分化，从而维持细胞的多能性；而在神经前体细胞中，WIP1基因通过调控Dickkopf相关蛋白3-无翅型MMTV整合位点家族-Wnt(DKK3-Wnt)信号通路来促进神经发生过程[29]；在生殖细胞发育过程中，WIP1基因通过Nemo样激酶-Wnt(NLK-Wnt)信号通路促进生殖细胞的分化[34]。WIP1基因敲除抑制胎儿成纤维细胞的成脂分化能力，PPARγ基因表达下调，表明WIP1基因可能在脂肪发育早期就具有潜在的调控作用，其异常表达可能导致脂肪发生过程的失调[25]。此外，WIP1蛋白对成脂分化关键蛋白PPARγ S112位点的去磷酸化能够提高PPARγ蛋白活性，进而促进脂肪生成[25]。本研究发现，WIP1基因通过上调PPARγ蛋白的表达来调控前脂肪细胞的分化，暗示其对PPARγ的调控作用不仅限于翻译后调控，在转录或翻译水平也可能具有调节，但具体分子机制及其在前脂肪细胞分化调控中的直接作用靶点有待深入的研究。由此可见，WIP1基因是一个对脂肪沉积具有重要作用的新候选基因，在瘦肉型猪的育种方面可能具有潜在的育种价值。

前脂肪细胞的增殖和分化对动物个体的脂肪沉积至关重要。小鼠脂肪组织在生长发育的早期(离乳期21日龄)和生长发育后期(性成熟期8周龄及中年期6月龄)呈现一定的规律，即在早期主要表现为脂肪细胞的增殖和定向分化，而在后期则以成熟脂肪细胞维持分化为主。为了验证WIP1基因在小鼠脂肪沉积过程中的潜在作用，本研究依据小鼠脂肪组织生长发育规律，选取了具有代表性的21日龄、8周龄和6月龄3个时期，并检测了不同生长阶段C57BL/6J小鼠的ingWAT和pgWAT中WIP1基因动态表达情况，结果显示，随着日龄的增长，小鼠脂肪组织中WIP1基因的表达显著提高，暗示其与脂肪沉积的相关性。研究发现，WIP1基因敲除小鼠体重和脂肪含量均显著低于对照组，且对高脂饮食诱导的肥胖模型具有显著的抵抗作用[23]，其体重显著低于野生型对照小鼠，具体表现为内脏脂肪沉积的降低，食物消耗水平降低和瘦素水平降低[24]。本研究发现WIP1基因的表达量随着小鼠日龄的增长呈显著的上升趋势，进一步验证了上述WIP1基因参与小鼠脂肪沉积调控的报道[23-24]。

4 结 论

本试验结果表明，干扰WIP1基因表达可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖和脂肪分化能力，显著降低细胞周期基因CyclinB1、CyclinD1和成脂分化相关标志基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、SCD1的表达量；WIP1基因在6月龄ingWAT和pgWAT表达量均极显著高于21日龄和8周龄。结果可为深入了解动物脂肪细胞的生成和功能提供参考。