儿童碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌感染的临床特征及分子流行研究

叶龙 张莉滟 赵越 顾兵 吴渚 彭永正,4

（1.南方医科大学珠江医院检验医学部，广东广州 510280；2.广东省人民医院检验科/广东省医学科学院，广东广州 510080；3.南方医科大学珠江医院儿科重症监护室，广东广州 510280；4.南方医科大学珠江医院输血科，广东广州 510280）

近年来，随着各种抗菌药物的广泛应用，碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）的检出不断上升，给临床抗感染治疗与医院感染防控带来巨大挑战，在世界范围内造成严重后果，2019年美国疾病预防控制中心最新的抗生素耐药性报告中，CRE仍是最紧迫问题［1-2］。儿童和新生儿因免疫力低下、用药局限等原因，更易导致CRE暴发流行，但目前现有研究多以成人为主，儿童群体相关数据尚不充分［3］。本研究旨在对广东省人民医院2018年1月至2021年6月儿童CRE感染情况进行分析，明确其耐药特性与分子流行特征，为对其有效防控及科学预判流行趋势提供依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

参照中国儿童细菌耐药监测组标准［4］，本文将≤14岁患儿纳入研究范围。回顾性分析广东省人民医院2018年1月至2021年6月住院患儿的相关临床资料及感染情况，共获得非重复菌株肠杆菌目细菌1 098株。按照全国临床检验操作规程［5］，对菌株进行相关实验。

1.2 试剂与仪器

哥伦比亚血琼脂与M-H琼脂培养基购自广州迪景公司；药敏纸片购自英国OXOID公司；PCR引物由TaKaRa公司合成，1×T3 Super PCR Mix及DNA Marker（DL-2000）购自擎科生物科技有限公司。VITEK MS微生物质谱检测系统与VITEK 2 Compact微生物鉴定仪及相关试剂购自法国梅里埃公司；PCR扩增仪购自美国ABI公司；电泳仪购自上海天能科技有限公司；凝胶成像系统购自美国Bi o-Rad公司。

1.3 质控菌株

大肠埃希菌ATCC 8739与ATCC 25922、阴沟肠杆菌ATCC 700323由广东省临床检验中心提供。

1.4 菌株鉴定与药敏试验

用配套仪器对部分细菌进行鉴定及药敏复核试验，采用M-H琼脂培养基行纸片扩散法验证厄他培南、亚胺培南、美罗培南的药敏情况，其中任何1种药物耐药，即可确定为CRE菌株。纸片扩散法操作及相关药敏结果的判读参照美国临床实验室标准化委员会M100-S32标准［6］，头孢哌酮/舒巴坦药敏结果的判读参照美国临床实验室标准化委员会M100-S32肠杆菌目细菌对头孢哌酮的折点标准［6］。

1.5 CRE初筛与确证试验

对CRE菌株采用改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）检测碳青霉烯酶，并联合EDTA改良碳青霉烯灭活试 验 （EDTA-modified carbapenem inactivation method，eCIM）检测金属酶，进行初筛试验。随后提取菌株基因组DNA，采用PCR法检测菌株所携带碳青霉烯酶耐药基因情况（引物设计参照相关文献［7-8］，引物序列见表1），PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统显像并观察结果。再将PCR扩增后产物送擎科生物科技有限公司测序，测序结果经基本局部比对搜索工具BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对分析，确定所测菌株携带的的耐药基因。

表1 碳青霉烯酶主要检测的耐药基因引物序列

1.6 统计学分析

采用WHONET 5.6及SPSS 26.0软件对数据进行分析。计数资料采用例数或百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿一般资料

1 098株肠杆菌目细菌中共检出CRE 66株，检出率为6.01%。66株CRE来自66例患儿，其中男37例（56%），女29例（44%）。年龄2 d至14岁，其中<1月龄16例（24%），1月龄~28例（42%），12月龄~11例（17%），>36月龄11例（17%）。住院中位时间32 d，CRE分离中位时间为入院后第12天。伴有基础疾病主要为呼吸道疾病（57例，86%）、心血管疾病（46例，70%）、消化道疾病（12例，18%）及肾脏疾病（10例，15%）等。多数患儿伴侵袭性操作，如气管插管（56例，85%）、手术（48例，73%）、静脉插管（41例，62%）、尿道插管（37例，56%）及穿刺引流（31例，47%）等。预后情况：治愈45例（68%），好转回所在地继续治疗14例（21%），死亡7例（11%），其中儿科重症监护室5例，新生儿科和儿童血液科各1例。死亡患儿患有急性胃肠炎、肺脓肿伴有肺炎、白血病、梗阻性脑积水、先天性心脏畸形等不同程度基础疾病，死因包括感染性休克2例、先天性心脏病2例、重症肺炎1例、血液病1例、脑肿瘤1例。

2.2 标本与科室分布

66株CRE主要在呼吸道、中段尿、血液标本中被检出；被检出CRE的患儿主要来自新生儿科、儿科重症监护室、儿童血液科、心外科重症监护室等科室。见图1。

图1 CRE的标本类型和科室分布 左图为标本类型分布（n=66）；右图为科室分布（n=66）。

2.3 致病菌分布

66株CRE中，肺炎克雷伯菌45株（68%）、大肠埃希菌12株（18%）、阴沟肠杆菌6株（9%）、黏质沙雷菌2株（3%）、产气肠杆菌1株（2%）。其中，新型冠状病毒肺炎（简称新冠）疫情发生前（2018~2019年）检出CRE 47株，检出率为6.5%（47/723）；新冠疫情发生后（2020~2021年）检出CRE 19株，检出率为5.1%（19/375）。虽然新冠疫情后住院患儿CRE的检出率低于新冠疫情前，但差异无统计学意义（χ2=0.899，P=0.343）。

2.4 主要CRE菌株药敏情况

66株CRE菌株对碳青霉烯类（亚胺培南、厄他培南）、青霉素复方制剂（氨苄西林/舒巴坦）、部分头孢类（头孢唑啉、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮/舒巴坦）抗菌药物高度耐药，对常见抗菌药物（氨曲南、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、庆大霉素）耐药性普遍偏高，仅对阿米卡星（14%）、左旋氧氟沙星（23%）、妥布霉素（33%）等耐药率相对较低，见表2。

表2 CRE感染患儿主要致病菌的耐药率 ［株（%）］

2.5 主要CRE的碳青霉烯酶耐药基因分析

PCR结果显示，45株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因型以blaNDM（20株，44%）、blaIMP（10株，22%）及blaKPC（5株，11%）为主；12株大肠埃希菌的碳青霉烯酶基因型以blaNDM为主（10株，83%）。测序结果经BLAST比对，blaNDM-124株，blaNDM-56株，blaIMP-45株，blaKPC-23株，仍有尚未明确基因型，有待进一步研究。

3 讨论

CRE感染给公共卫生防控带来严峻挑战，据中国细菌耐药监测网数据显示［9］：肺炎克雷伯菌对亚胺培南与美罗培南的耐药率从2005年的3.0%、2.9%持续上升至2018年的25.0%、26.3%，虽然2019年和2020年呈下降趋势，但2021年又有回升。儿童尤其新生儿因免疫力低下、用药局限等原因，CRE的检出率高于成人，且易引起流行。多项研究表明，临床分离的肺炎克雷伯菌在儿科病房有显著增高趋势，且儿童医院CRE的分离率要高于综合性医院［10-12］。

本研究中CRE菌株的检出率为6.01%，与报道［13］一致。据中国儿童细菌耐药监测组数据［13-14］，2020年儿童CRE总体检出率为4.9%，低于2019年的8.2%，均低于同时期以成人为主的相关数据［15-16］。本研究试着分析新冠疫情发生前后肠杆菌目细菌检出情况，结果差异无统计学意义，这表明疫情防控可能对我院儿童CRE检出影响不大，需要长期关注。

66例CRE患儿集中在新生儿科和儿科重症监护室，<12月龄占比最多，与研究［17-18］一致。一方面这可能与患儿免疫系统不成熟、住院时间久和频繁进行侵入性操作有关，且患儿相较于成人，需要医生护士的协助较多，相互间接触概率增加，进而加大CRE院内传播的机会。另一方面我院碳青霉素类抗菌药物主要用于危重症监护室，以及免疫力低下患者，如烧伤科、血液科等。有研究［19］表明，重症监护室的病原菌容易呈现多重耐药的特点，同时重症监护室环境中更容易出现耐药菌的定植，增大CRE感染风险。再者，儿童用药原则与成人不同，其抗感染可用的药物选择有限，在当前新生儿或儿科重症的治疗中超说明书用药现象常见，这也是CRE菌株检出率高的原因之一。

CRE最主要的耐药机制是产碳青霉烯酶［20］，利用mCIM联合eCIM初筛试验可将其初步分为金属酶和丝氨酸酶。有研究报道，金属酶对碳青霉烯类药物具有较强水解能力，可导致高水平耐药发生，会给临床治疗带来极大困难［21-22］。本研究碳青霉烯酶的耐药基因以NDM型、IMP型、KPC型为主，与报道［16］相一致；45株肺炎克雷伯菌中，以产NDM型和IMP型金属酶为主，与报道［23-24］相符，这与成人中以产KPC型丝氨酸酶为主不同；另12株大肠埃希菌也以NDM型金属酶为主。本研究66株CRE菌株对常见抗菌药物耐药性均普遍偏高，仅对部分氨基糖苷类和喹诺酮类药物耐药率相对较低。但由于氨基糖苷类和喹诺酮类药物的不良反应，对儿童革兰阴性多重耐药菌感染的治疗主要依赖于碳青霉烯类药物，加之儿童免疫力低下，一旦发生CRE感染，临床治疗较成人更加严峻，常陷入无药可用的境地，亟待新型抗菌药物的研发［25］。近些年，联合应用多黏菌素、替加环素与磷霉素等疗法；新型β-内酰胺酶抑制剂（齐德巴坦、纳库巴坦等）及新型β-内酰胺酶抑制剂复合制剂（头孢他啶/阿维巴坦、亚胺培南/瑞巴坦、美罗培南/法硼巴坦等）正被积极开发，给CRE抗感染治疗带来一线曙光［26］。新型β-内酰胺酶抑制剂复合制剂的抗CRE感染作用也与碳青霉烯酶的基因型高度相关，有研究报道头孢他啶/阿维巴坦对产KPC或OXA-48型丝氨酸酶菌株具有疗效，但其对产NDM金属酶菌株的治疗无明显效果［27］。因此，儿童CRE患者在应用此类药物前，务必要加强临床与检验的沟通，及时明确碳青霉烯酶基因型，同时积极探索快速检测碳青霉烯酶基因型的方法［28］。现今关于这些新型抗菌药物的临床经验及评估它们用于儿童人群的临床报道都很有限，儿童CRE感染治疗仍然具有挑战性。本研究中有部分CRE菌株的碳青霉烯酶基因型未明确，有待深入探讨，以便全面了解儿童CRE的耐药机制与分子流行情况，为患儿临床治疗和感染防控提供更多线索。

综上所述，儿童CRE感染发生率高，且集中于1~12月龄婴儿。CRE对抗菌药物的耐药性普遍偏高，儿童感染CRE菌株的碳青霉烯酶以金属酶为主。积极开展CRE主动筛查，加强儿童病区环境卫生学监测，提升医护人员防控意识，优化抗菌药物使用，从而遏制儿童CRE感染的暴发与流行。