玉液汤调控自噬相关机制改善早期糖尿病肾病的机制探讨

吴小翠，杨诏钧，杨智华，李坚昊，程亚伟，谢毅强

（1. 海南省中医院内分泌科，海南海口 570203；2. 广州中医药大学，广东广州 510006；3. 海南省中医院治未病科，海南海口570203；4.海南医学院中医学院，海南海口 571199）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常见且对微血管危害最大的慢性并发症，目前患病率约为30%～40%［1］。随着糖尿病患病人数迅速增长，DKD 的患病率也呈逐年上升的趋势。DKD 的病变可累及全肾，是终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）的主要原因［2］，若病情进一步进展至ESRD，其患者5 年生存率将大大降低［3］。早期DKD 主要以白蛋白尿和糖尿病视网膜病变为主要临床特征，病情尚处可控阶段，因此通过治疗延缓早、中期DKD 意义重大。但DKD 病因复杂，发病机制尚未明确，缺乏针对性的治疗手段，而中医中药则可为DKD 患者提供解决问题的另一途经。

DKD 由中医认为的“消渴”发展而来，临床表现属“水肿”、“关格”、“尿浊”等相关疾病范畴，亦可称为“消肾”。早期DKD 证型多表现为燥热阴虚证或气阴两虚证，治疗宜用清热养阴或益气养阴法，玉液汤则是其中的代表方［4，5］。玉液汤源于张锡纯所著的《医学衷中参西录》，具有益气养阴、生津止渴的作用，既往的研究中已证实其治疗糖尿病疗效显著［6，7］。现代药理学研究证明其在降低血糖、改善体内细胞对胰岛素敏感性、改善氧自由基代谢紊乱等方面具有明显的作用［8，9］，但其作用机制尚未被完全阐明。

自噬（autophagy）是以一种溶酶体为介导的生物过程。该过程可通过降解细胞内异常蛋白质和受损细胞器，加速新陈代谢，进而维持细胞稳态［10］。大量研究证实糖尿病肾脏细胞自噬失调可能导致肾小球固有细胞和肾小管间质病变［11，12］，且肾脏细胞自噬活性可受胰岛素调节［13］。既往研究表明，玉液汤中的黄芪、葛根可调控病理状态下信号通路的失衡，逆转葡萄糖诱导的足细胞上皮间充质转分化，进一步抑制因高糖刺激引起的肾系膜增生，起到减缓肾组织损害的作用［14，15］。因此玉液汤可能通过调节肾脏细胞自噬过程，从而延缓DKD 进程。

本研究运用网络药理学、GEO 数据挖掘、分子对接等手段对玉液汤治疗糖尿病肾病的自噬相关机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1 获取糖尿病肾病与自噬相关基因

1.1.1 转录组数据下载 检索GEO 平台，限制搜索条件为GEO 数据库中所有子库的所有类型的糖尿病肾病，样品类型设置为转录组基因表达情况，选择下载GSE30122 数据集。

1.1.2 转录组数据整理及ID 转换 利用自制Perl语言脚本moveFiles.pl 和merge.pl 对已下载的转录组数据进行整理，输出mRNAmatrix 与normal-Tumor 两个文件；整理得出数据后，利用R 语言中的clusterProfiler 包将有关基因ID 转换为基因名称。

1.1.3 提取自噬相关基因 将“1.1.2”中已转换名称的基因通过自制Perl 软件脚本的Autophagyexp.pl 进行数据转换，检索人类自噬数据库（Human autophagy database）提取并输出自噬相关基因。

1.1.4 自噬基因差异表达分析 利用R 语言中的BiocManager 和limma 包，设置工作目录为“1.1.3”所得的自噬相关基因的表达量，设置错误发现率（false discovery rate，FDR）与差异倍数的对数（log-FC）的临界值。设置完成后，在R 软件中读取数据，并进行差异分析，得到表达差异的P值、FDR 值和logFC 值。

1.1.5 数据可视化 根据“1.1.4”所得的表达差异情况可绘制所有样品中自噬相关基因表达的热图，将差异分析所得的数据可视化。

1.2 玉液汤治疗糖尿病肾病的网络药理学研究

1.2.1 获取玉液汤基因信息 在TCMSP 数据库（version2.3，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以玉液汤组成成分作为搜索词，检索获得其化学成分。考虑到体内中药成分的血药浓度，在检索结果中限定条件为口服生物利用度大于等于30%和类药性大于等于0.18 进行筛选，获得对应的化学成分信息，并以其作为潜在有效活性成分，同时在平台中获得各成分所对应的潜在作用靶点。通过Uniprot数据库查找所有靶点所对应的基因名和编号。

1.2.2 获取与自噬相关的玉液汤治疗糖尿病肾病的靶点 将“1.1.3”中获得的糖尿病肾病自噬相关的差异基因与“1.2.1”中获得的玉液汤潜在作用靶点进行映射，获得治疗靶点。建立有效活性成分与靶点对应关系，将结果导入Cytoscape 3.7.2 中，得到“药物-有效活性成分-靶点”网络。

1.2.3 蛋白相互作用网络构建与分析 将“1.2.2”中得到的治疗靶基因导入String 基因互作网络数据库（https：//string-db.org/），将物种选择为“Homosapiens”，将经过筛选得到的靶点在“Multiple proteins”中进行检索，选择置信度为0.400，保存蛋白互作信息为TSV 格式文件。将TSV 文件导入Cytoscape3.7.2 软件中，并用NetworkAnalyzer 工具进行网络分析，获得Degree 值（连接度），以设置Degree值为大于其中位数的2 倍为条件，筛选出核心蛋白绘制PPI 网络图。

1.2.4 GO 生物学过程富集分析和KEGG 通路富集分析 利用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）进行GO 生物学过程富集分析及KEGG通路富集分析。根据GO 生物学过程富集分析所得的有关基因的矫正后的P值绘制GO 条形图，其中主要使用R 语言中的digest 包和GOplot 包；根据KEGG 通路富集分析所得的logFC 值绘制KEGG气泡图，其中主要使用的R 包与GO 条形图绘制类似。

1.3 分子对接验证

在“1.2.1”得到的“药物-有效活性成分-靶点”网络中，通过使用CentiScape 计算有效活性成分的Degree 值，筛选出Degree 值最高的活性成分与PPI网络筛选出来的核心靶点进行分子对接。

化合物2D 结构通过PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取；靶基因3D 结构通过PDB 数据库（http：//www.rcsb.org）获取。使用Chem3D 对化合物2D 结构进行3D 再处理，Autodock Vina 软件进行活性口袋分析以及分子对接，利用Pymol 软件对结果进行输出优化。

2 结果

2.1 糖尿病肾病与自噬相关基因统计

检索GEO 数据库中人类物种的糖尿病肾病数据，样品类型设置为人转录组基因，下载到转录组基因数据25 523 个。检索人类自噬数据库（human autophagy database），并与人糖尿病肾病转录组基因相映射，提取自噬相关基因病进行根据基因差异化表达进行差异分析，绘制自噬相关基因表达量差异分析热图（图1），得到符合条件的糖尿病肾病与自噬相关基因100 个。

图1 GSE30122 中自噬相关基因表达量差异分析热图Fig 1 Heat map for differential analysis of autophagy-related gene expression in GSE30122

2.2 与自噬相关的玉液汤治疗糖尿病肾病的作用靶点

在TCMSP 数据库中，以生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 为筛选条件分别得到玉液汤（山药、黄芪、知母、葛根、五味子、天花粉、鸡内金）的活性成分共78 个，以及对应的靶点3 678 个。剔除重复项和无对应活性成分的靶点后，得到玉液汤的潜在作用靶点共1 428 个。将获得的糖尿病肾病与自噬相关的基因与玉液汤潜在作用靶点进行映射，获得22 个治疗靶点与其对应的基因名称、编号（表1）。

表1 玉液汤治疗糖尿病肾病与自噬相关的基因Tab 1 Autophagy Related Genesin treating diabetic nephropathy with Yuye Decotion

2.3 PPI 网络的构建

将与自噬相关的玉液汤治疗糖尿病肾病的靶点输入String 数据库，限定物种选择为“Homo sapiens”，置信度为0.400，得到核心靶点的PPI 网络。将得到的数据以TSV 的格式导入到Cytoscape 3.7.2 中。筛选出Degree 值较大的靶点作为PPI 核心网络，得到玉液汤治疗糖尿病肾病的核心靶点包括VEGFA、ERBB2、GASP3、MAPK8、MYC、CDKN1A、EGFR、BCL2L1 等，具体见图2。

图2 玉液汤治疗糖尿病肾病的自噬相关蛋白质相互作用网络图Fig 2 Interaction network of autophagy-related proteins in diabetic nephropathy treated with Yuye Decotion

2.4 GO 生物学过程富集分析结果

利用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）对1.2.2 中得到的治疗靶点基因进行GO 生物学过程富集分析。使用R 语言中的digest 包和GOplot 包，根据GO 生物学过程富集分析所得的有关基因矫正后的P 值绘制GO 条形图，如图3；根据结果，发现玉液汤治疗糖尿病肾病与自噬相关的通路可能包括mTOR 信号通路（mTOR signaling pathway）、磷脂酶D 信号通路（phospholipase D signaling pathway）、胰岛素抵抗（Insulin resistance）、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、细胞凋亡（Apoptosis）等。

图3 基于GO 分析的玉液汤治疗糖尿病肾病与自噬相关的通路条形图Fig 3 Bar graph of pathways associated with autophagy in the treatment of diabetic nephropathy with Yuye Decotion based on GO analysis

2.5 KEGG 通路富集分析结果

根据KEGG 通路富集分析所得的logFC 值绘制KEGG 气泡图，如图4，其中主要使用的R 包与GO 热图绘制类似。由图可得玉液汤治疗糖尿病肾病与自噬相关的通路可能有mTOR 信号通路（mTOR signaling pathway）、PI3K /Akt 信号通路（PI3K /Akt signaling pathway）、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、NF-κB 信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、细胞凋亡（Apoptosis）等。

图4 基于KEGG 分析的玉液汤治疗糖尿病肾病的自噬相关通路气泡图Fig 4 Autophagy-related pathway bubble map based on KEGG analysis of Yuye Decotion for diabetic nephropathy

2.6 分子对接验证结果

根据“药物-有效活性成分-靶点”网络中运算结果筛选出玉液汤“山药、黄芪、知母、葛根、五味子、天花粉”6 味核心药物中的核心活性成分共4 个，分别是槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、薯蓣皂素（diosgenin）、山柰酚（kaempferol），以及8个核心靶点蛋白（BCL2L1、CASP3、CDKN1A、EGFR、MAPK1、MAPK8、MYC、VEGFA），对核心活性成分与核心靶点蛋白进行分子对接。

在分子对接中，配体和受体二者结合越稳定，两者自由能越低。结果显示槲皮素与MYC、MAPK1、BCL2L1、CASP3、VEGFA 这5 个核心靶点蛋白的自由能均小于-6.0 kcal/mol，与CDKN1A、EGFR 这2 个核心靶点的自由能较高，部分结果见表2；β-谷甾醇与CASP3 的自由能为-6.0 kcal/mol；薯蓣皂素与CDKN1A、VEGFA 的自由能分别为-5.5 kcal/mol、-8.3 kcal/mol；山柰酚与MAPK8 的自由能为-8.2 kcal/mol。

表2 核心活性成分槲皮素与部分核心靶点蛋白结合能（kcal/mol）Tab 2 Binding ability of core active ingredient quercetin to some core target proteins（kcal/mol）

将分子对接结果在Pymol 软件进行视觉优化后，输出分子对接三维图，蓝色为小分子配体，绿色为大分子受体结果，部分结果见图5、6。

图5 CASP3 对接山柰酚（自由能-7.3 kcal/mol）Fig 5 CASP3 docking with kaempferol（free energy = -7.3 kcal/mol）

图6 VEGFA 对接槲皮素（自由能-8.1 kcal/mol）Fig 6 VEGFA docking with quercetin（free energy = -8.1 kcal/mol）

3 结论

糖尿病肾病是糖尿病发展过程中最为常见的器官并发症，发病前期隐匿性较强，早期症状并不明显，但随着病情不断发展会导致出现肾功能衰竭。目前临床对糖尿病肾病尚无根治方法，主要是通过饮食控制、运动管理、血糖血压控制等稳定病情［16］。糖尿病肾病在中医学上属于“尿浊”、“水肿”、“消瘅”等疾病范畴。中医经典《灵枢》中提及：“五脏皆柔弱者，善病消瘅。”指出消渴的发病机制与五脏功能减退、阴血亏虚、精气不足有关。因此中医认为糖尿病肾病的发病与劳欲过度、肾精亏损、肾中虚寒等息息相关，在治疗上主张益气养阴、活血生津、补肾健脾［17］。本研究采用的中药汤剂选自张锡纯所著的《医学衷中参西录》中的玉液汤，方用山药、黄芪、知母、葛根、天花粉，脾肾双补，兼用五味子、鸡内金收敛固涩，标本兼顾。

西医方面认为，糖尿病肾病与细胞自噬密切相关。自噬属于细胞的一种应激反应，在糖尿病肾病状态下，肾脏中高糖状态使常规的自噬通路受损，自噬通路状态的改变可以调控由胞内压力引起的机体正常的自噬反应，从而加剧细胞内环境紊乱的情况，最终导致糖尿病肾病的发生［18］。本研究通过构建“药物-有效活性成分-靶点”网络以及分子对接方法，试图探讨与自噬相关的玉液汤治疗糖尿病肾病的机制。

玉液汤治疗糖尿病肾病核心靶点包括VEGFA、ERBB2、CASP3、MAPK8、MYC、CDKN1A、EGFR、BCL2L1 等，均与细胞自噬相关。在2 型糖尿病中，VEGFA 参与调控的机械性通路，会导致肾小球多糖-蛋白复合物丢失，包括高血糖和ROS。研究显示，这一过程可能与患者VEGF-A165b（一种VEGFA 拮抗剂）的表达丢失有关［19］。

本研究在GO 生物学过程富集分析和KEGG 通路富集分析中发现，玉液汤治疗糖尿病肾病与细胞自噬相关的通路有mTOR 信号通路、PI3K/Akt 信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗、NF-κB 信号通路、细胞凋亡等。PI3K 是PI3K-Akt 通路激活的关键调节酶，可作为一种细胞内磷脂酰肌醇激酶调节其下游分子的活性。研究表明，PI3K-Akt 通路激活可以改变足细胞标志蛋白的表达，进而改变标志蛋白的结构，影响足突结构的完整，使得功能失调。PI3K-Akt 通路可与p38-MAPK 通路共同介导肾小管上皮细胞凋亡，改善肾小管功能［20］。mTOR 激酶的活化是关闭细胞自噬的一个主要抑制性信号，可抑制自噬体的形成。细胞因子可通过Akt 或ERK1/2 向mTORC1 传递信号，便会活化结节性硬化症-2（TSC2），减少mTORC1 的抑制信号，进而引发自噬。mTORC2 能够激活Akt，对细胞生存起正向调节作用。被活化了TSC2 的mTORC1 还可以激活下游转录因子TFEB，引发进一步的自噬作用，同时，被mTORC1 活化的下游基因缺氧诱导因子-1（HIF-1）诱导血管内皮生长因子（VEGF）生成，进而新生血管形成［19］。NF-κB 是一个转录因子蛋白家族，作为细胞内多个通路的中心环节，它的活化能调节各种化学趋化因子、细胞黏附分子的转录与表达；NF-κB 的活化，可激活TNF-α 和白细胞介素-1β 的转录，这些细胞趋化因子不仅会反向调节NFκB 使其进一步激活，也能在血液中诱导产生新的趋化因子聚集在炎症反应发生部位，导致炎症反应的进一步扩散并进一步诱发糖尿病肾病，是糖尿病肾病形成的重要因素［21］。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一种由巨噬细胞对细菌感染或其他免疫源反应自然产生的细胞因子，根据其来源和结构不同分为两种类型，即TNF-α 和TNF-β，可促进细胞增殖和分化，是重要的炎症因子，并参与某些自身免疫病的病理损伤。其中TNF-α 的含量随着糖尿病肾病的病情发展表达水平升高，因此可以用来判断糖尿病肾损伤的程度［22］。

本研究根据“药物-有效活性成分-靶点”网络中运算结果筛选出玉液汤组方药物中的4 个核心活性成分，分别是槲皮素、β-谷甾醇、薯蓣皂素和山柰酚。有研究表明槲皮素能够减轻高糖分对于人肾小球内皮细胞的伤害，可能通过PI3K/AKT 通路的激活促进细胞对抗凋亡及拮抗氧化应激作用来实现［23］。山柰酚可通过抑制细胞增殖对高糖培养的大鼠肾系膜细胞起到保护作用［24］。薯蓣皂素可以抑制血清肌酐的累积，减少尿蛋白的生成，从而改善肾功能；亦可通过降低MPO 活性进一步抑制转录因子NF-κB 的磷酸化［25］。分子对接结果显示，玉液汤组方药物中的核心活性成分和与自噬相关的大多数治疗核心靶点具有较好的相互作用与结合活性。

综上所述，本研究采用网络药理学结合分子对接的方法，分析了玉液汤治疗糖尿病肾病过程中与自噬相关的核心靶点功能和可能的信号通路，证实玉液汤通过多成分、多靶点、多通路作用治疗糖尿病肾病，为后续针对玉液汤治疗糖尿病肾病自噬相关方面的作用机制研究提供了依据。但本研究未能对所得到的靶点及通路开展相关实验进行验证，此将成为下一步研究的重点。

作者贡献度说明：

吴小翠、杨诏钧：网络药理学部分的分析与撰写，以及中医理论探讨部分的撰写；李坚昊：讨论中相关综述内容的撰写；杨智华：本文英文摘要的撰写；程亚伟：本文引言部分有关DKD 流行病学的资料查找及撰写；谢毅强：项目负责人，对本篇论文的指导与审校。