海藻玉壶汤调控蛋白质翻译后修饰抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖的机制研究

张凤暖，高天舒

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳 110000）

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）属于分化型甲状腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC），是甲状腺癌（thyroid cancer，TC）中最常见的组织学类型，约占所有甲状腺恶性肿瘤的80%～90%［1］，大部分DTC 对手术、131I 残甲消融和TSH 抑制治疗反应良好，可长期生存，5 年生存率可达98%［2］。但是约23%的DTC 患者会发生远处转移，其中约1/3 在其自然病程或治疗过程中逐渐表现出聚碘能力下降，对放射性131I 治疗不敏感，发展为放射性碘难治性分化型甲状腺癌［3］（radioiodine refractory differentiated thyroid cancer， RAIRDTC），是临床治疗的难点，10 年生存率下降至10%［4］。BRAFV600E基因突变是PTC 最常见的突变位点，是RAIR-DTC 形成的重要分子基础之一［5，6］。BRAF 是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径关键激活因子之一，BRAFV600E基因15 号外显子上第600 位的氨基酸——缬氨酸（V）突变为谷氨酸（E），导致MAPK 通路持续激活，刺激PTC 细胞增殖和RAIR-DTC形成［7］。

甲状腺癌属中医“石瘿”范畴，《三因极一病证方论》“坚硬不可移者，名曰石瘿。”《外科正宗》记载“夫人生瘿瘤之症，非阴阳正气结肿，乃五脏瘀血、浊气、痰滞而成。”清代《医宗金鉴》言“石瘿海藻玉壶汤主之”，海藻玉壶汤（HYD）首见于明·陈实功《外科正宗》，距今400 余年，是治疗瘿瘤的名方。海藻玉壶汤由海藻、贝母、陈皮、昆布、青皮、川芎、当归、半夏、连翘、甘草、独活、海带组成，具有化痰软坚、理气消瘿的作用。

研究显示，PTC 术后在TSH 抑制治疗基础上加用海藻玉壶汤，能有效改善甲状腺功能，降低Tg［8］；海藻玉壶汤能显著抑制实验性TC 荷瘤小鼠趋化因子受体CXCR4 基因及蛋白表达减缓肿瘤进展［9］。海藻玉壶汤还可通过影响细胞周期、诱导凋亡抑制实验性肝癌增殖［10］，通过降低胸腺淋巴瘤小鼠全血黏度和红细胞聚集，缓解痰凝血瘀体征，抑止肿瘤进展［11］。以上研究均提示海藻玉壶汤可能从多方面多角度发挥抗癌作用。本团队前期研究显示海藻玉壶汤及其拆方可降低实验性低碘甲状腺肿大鼠甲状腺组织氧化应激反应［12，13］，促进NIS蛋白表达［14］，并且富碘中药与无机碘的作用存在差异［15］。但是，国内外对海藻玉壶汤在PTC 中的应用研究尚少，因此开展本研究。

本研究选择PTC 中最常见的致癌基因——BRAFV600E突变驱动的PTC 细胞系BCPAP 细胞为研究对象，通过体外实验，初步评估海藻玉壶汤含药血清对BCPAP 细胞增殖的抑制作用，为深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与实验动物

1.1.1 细胞株 人甲状腺乳头状癌细胞BCPAP，人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1，购自中国科学院上海细胞库。含10%胎牛血清的1640 培养基，37 ℃、5%CO2的培养箱内培养。

1.1.2 实验动物 健康雌性SPF 级SD 大鼠40 只，6～8 周龄，体质量190～220 g，动物合格证号：SCXK（辽）2015-0001，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。

1.2 药物与试剂

海藻玉壶汤汤剂制备：海藻15 g、昆布15 g、海带7.5 g、浙贝母15 g、半夏15 g、青皮15 g、陈皮15 g、川芎15 g、当归15 g、连翘15 g、甘草15 g、独活15 g，购自辽宁中医药大学附属医院中药房。以上药物加水浸泡2 h，煎煮3 次，每次煎煮40 min，合并3 次煎煮液后浓缩成含生药2 g/mL，4 ℃冰箱中保存备用。

1640 培养基（货号：31800-014），购自美国Gibco 公司；胎牛血清（货号：04-001-1ACS），购自美国BI；BRAFV600E抑制剂PLX4032（货号：HY-12057），购自美国MCE 公司；KIO3（货号：P116291），购自中国Aladdin 公司；细胞外调节蛋白激酶（ERK，货号：WL02195），购自中国wanleibio 公司；磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK，货号：WLP1512），购自中国wanleibio 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号：WLA004），购自wanleibio 公司；ECL 发光液（货号：WLA003），购自wanleibio 公司；PVDF 膜（货号：IPVH00010），购自美国Millipore 公司；MTT（货号：KGA311），购自美国凯基。

1.3 含药血清的制备

40 只健康雌性SD 大鼠，随机分为中药组和空白对照组，每组20 只。中药组按体表面积比换算给药剂量，生药含量15.5 g/kg，日2 次灌胃；空白对照组给予等体积去离子水。连续灌胃1 周，末次给药后1 h，常规麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min 分离血清，同组样本混合后，0.22 μm 滤器过滤除菌，56 ℃灭活30～40 min，-80 ℃保存。

1.4 主要仪器设备

倒置相差显微镜（AE31）；酶标仪（ELX-800）；双垂直蛋白电泳仪（DYCZ-24DN）；转移槽（DYCZ-40D）；凝胶成像系统（WD-9413B）。

1.5 实验分组及干预措施

体外实验分为6 组，A：正常对照组（人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1+空白血清）；B：模型对照组（BCPAP 细胞+空白血清）；C：PLX4032 组（BCPAP 细胞+空白血清+0.1 μmol/L PLX4032［16］）；D：HYD 组（BCPAP 细胞+20%HYD 含药血清）；E：HYD+PLX4032 组（BCPAP 细胞+20%HYD含药血清+0.1 μmol/L PLX4032）；F：高碘水组（BCPAP 细胞+空白血清+13.4 μg/mL KIO3）。

1.6 MTT 法检测细胞增殖能力

取对数生长期的Nthy-ori3-1、BCPAP 细胞，胰酶消化后，调节细胞密度2×106个/mL，接种于96孔板，按实验分组加药处理，每组设计5 个复孔，接种后置于37 ℃、5%CO2培养箱中，细胞分别于培养8、24、72 h，加入50 μL 1×MTT，置于37 ℃培养箱中孵育4 h，吸去上清，加入150 μL DMSO 溶解细胞形成的紫色结晶，在酶标仪上测定其在570 nm 处OD 值。

1.7 Western blot 检测ERK、pERK

裂解液抽提总蛋白，BCA 法进行蛋白质定量，蛋白样品20 μL 加入到SDS-PAGE 凝胶中进行电泳分离，将蛋白转印至PDVF 膜上，5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，一抗，4 ℃过夜。TBST 漂洗4 次，加入二抗室温孵育45 min，TBST 漂洗6 次后，滴加ECL 显影液，凝胶图象处理系统分析目标条带的光密度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 海藻玉壶汤含药血清对BCPAP 细胞增殖活性的影响

MTT 检测结果显示，海藻玉壶汤含药血清对BCPAP 细胞增殖抑制作用随时间推移逐渐呈现。8 h 时各组间增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常对照组比较，模型对照组在24、72 h 时BCPAP 细胞增殖活性显著增强（P＜0.05）；24 h 时，PLX4032 组、20%HYD 组、HYD+PLX4032 组均对BCPAP 细胞增殖显示出抑制趋势，但与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；72 h 时，与模型对照组比较，PLX4032 组、20%HYD 组、HYD+PLX4032 组细胞增殖活性显著被抑制（P＜0.05），高碘水组与模型对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；与高碘水组比较，PLX4032 组、20%HYD 组、PLX4032+20%HYD 组细胞增殖活性显著被抑制（P＜0.05），见表1，不同组别随时间变化增殖活性趋势见图1。

图1 海藻玉壶汤含药血清对BCPAP 细胞增殖活性的影响Fig 1 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on proliferation activity of BCPAP cells

表1 海藻玉壶汤含药血清对BCPAP 细胞增殖活性的影响（n=5，±s）Tab 1 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on proliferation activity of BCPAP cells（n=5，±s）

表1 海藻玉壶汤含药血清对BCPAP 细胞增殖活性的影响（n=5，±s）Tab 1 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on proliferation activity of BCPAP cells（n=5，±s）

注：与正常对照组比较：*P＜0.05；与模型对照组比较：△P＜0.05；与高碘水组比较：#P＜0.05。

组别细胞增殖活性（OD 值）8 h24 h72 h.186±0.0310.252±0.0320.435±0.080 0.638±0.078*0.407±0.067△#0.387±0.045△#0.328±0.032△#0.599±0.046*20.870 0.000正常对照组模型对照组PLX4032 组20% HYD 组HYD+PLX4032 组高碘水组FP 0 0.216±0.031 0.206±0.023 0.207±0.021 0.195±0.022 0.211±0.036 0.793 0.565 0.333±0.031*0.292±0.036 0.288±0.033 0.265±0.030 0.315±0.037 4.118 0.008

在抑制BCPAP 细胞增殖的作用上海藻玉壶汤含药血清与PLX4032 具有协同增效作用（F=10.87，P=0.005）。

2.2 海藻玉壶汤含药血清对BCPAP 细胞ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达的影响

Western Blot 结果显示各组间ERK1/2 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），但各组间p-ERK1/2 蛋白表达存在显著差异（P＜0.05）：与正常对照组比较，模型组p-ERK1/2 蛋白表达显著增加（P＜0.05）；与模型对照组比较，PLX4032 组、20%HYD 组、HYD+PLX4032 组p-ERK1/2 蛋白表达显著下降（P＜0.05），高碘水组与模型对照组差异无统计学意义（P＞0.05），图2A 为Western Blot条带，图2B 为条带灰度分析对比直方图。

图2 海藻玉壶汤含药血清对BCPAP 细胞ERK、p-ERK 蛋白表达的影响Fig 2 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on the expression of ERK and p-ERK proteins in BCPAP cells

表2 BCPAP 细胞增殖析因设计方差分析（±s）Tab 2 Analysis of variance of factorial design for BCPAP cell proliferation（±s）

表2 BCPAP 细胞增殖析因设计方差分析（±s）Tab 2 Analysis of variance of factorial design for BCPAP cell proliferation（±s）

干预因素HYD PLX4032 HYD*PLX4032增殖活性0.387±0.045 0.407±0.067 0.328±0.032 F P 40.01 30.90 10.87 0.000 0.000 0.005

3 讨论

海藻玉壶汤是治疗瘿瘤的名方，并在PTC 以及多种癌症中显示出抑制癌细胞增殖，延缓肿瘤进展的作用［7-10］。本研究选用带有BRAFV600E突变遗传背景的PTC 细胞系BCPAP 细胞为研究对象，使用含药血清加药方式给予体外干预。中药复方以含药血清方式添加至细胞中，利用了生物体对中药复杂成分的代谢和滤过，能够反映中药在机体内经消化吸收产生药效的真实情况［17，18］。选择20%海藻玉壶汤含药血清，以8、24、72 h 作为观察时点开展海藻玉壶汤对BCPAP 细胞增殖抑制研究。选择PLX4032 作为阳性对照药，PLX4032 又名Vemurafenib，是B-Raf 酶抑制剂。海藻玉壶汤为富碘中药复方，海藻、昆布、海带为富碘中药［19，20］，因此在本研究中特设置与海藻玉壶汤相同碘含量的KIO3水组作为对照，用于解释海藻玉壶汤复方作用与单纯碘剂的差异。

细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERKs）分为 ERK1 和 ERK2，是MAPK 信号通路最终效应因子，主要参与细胞生长与分化。经典的ERK 活化通路由细胞外不同刺激配体结合到细胞膜上的受体酪氨酸激酶，激活GTP蛋白，顺序激活RAF、MEK，最终磷酸化ERK 蛋白，促使其活化为p-ERK，进而易位到细胞核，磷酸化细胞核内转录因子，促进细胞生长分化。BRAFV600E突变，Raf-MEK-ERK 信号通路持续激活，刺激细胞增殖和转移，在癌症发展中起关键作用［21］。

本研究显示BCPAP 细胞增殖活性明显高于正常甲状腺细胞，海藻玉壶汤含药血清干预后，BCPAP 细胞增殖活性被显著抑制。对MAPK 通路上ERK 蛋白表达的分析显示，BCPAP 细胞与正常甲状腺细胞中ERK 蛋白表达无差异，而p-ERK 蛋白表达显著增加，海藻玉壶汤含药血清干预后，p-ERK蛋白表达降低，但仍高于正常甲状腺细胞组，其疗效与PLX4032 相当。提示海藻玉壶汤抑制BCPAP细胞增殖的作用可能通过抑制ERK 蛋白磷酸化实现。蛋白质磷酸化是调节蛋白质活力和功能最基本、最重要的机制，在细胞信号转导中起至关重要的作用［22］。研究显示来源于海藻、连翘的槲皮素，来源于青皮、陈皮的川陈皮素和来源于半夏的黄芩素，是海藻玉壶汤的重要活性成分，与PTC 核心靶点具有较强的结合力，可能对PTC 具有直接的治疗作用［23］。槲皮素可以提高H9C2 细胞p-MAPK 和p-ERK1/2 磷酸化水平［24］，Raf 和MEK 蛋白激酶是槲皮素化学预防作用的直接分子靶标［25］。黄芩素可显著降低甲状腺未分化癌细胞p-ERK/ERK 比值［26］。川陈皮素与顺铂联用可以有效降低甲状腺未分化癌细胞活力［27］，与索拉非尼有强协同作用［28］。海藻玉壶汤与PLX4032 合用，有协同增效作用，海藻玉壶汤能否缓解PLX4032 耐药性值得深入研究。

海藻玉壶汤是富碘中药复方［19，20］，一直以来，碘对甲状腺癌的影响存在较大争议。大多数的研究表明碘缺乏是甲状腺肿瘤启动和促进因素［29］，纠正碘缺乏症可能会使甲状腺癌亚型向恶性程度降低的方向转变［30，31］，但不会影响甲状腺癌的总体风险［32］。碘过量作为甲状腺癌的危险因素证据不足［33］，有限的病例研究提示碘摄入量增加是甲状腺癌的保护因素［34］，富含碘的食物可能对甲状腺癌发生风险起保护作用［32，35］。本研究结果显示，与海藻玉壶汤煎剂具有相同碘含量的高碘水组并无抑制BCPAP 细胞增殖和ERK 磷酸化的作用，提示海藻玉壶汤含药血清抑制BCPAP 细胞增殖可能与富含碘无关；高碘水组呈现出与模型组相似的增殖状态，无过度增殖发生，这在一定程度支持海藻玉壶汤中所含剂量碘不是甲状腺癌的危险因素。

海藻玉壶汤含药血清对BCPAP 细胞增殖具有抑制作用，其机制可能是通过抑制ERK1/2 蛋白磷酸化这一蛋白质翻译后修饰过程抑制BCPAP 细胞增殖；海藻玉壶汤含药血清可能具有协助增强PLX4032 疗效的作用。

作者贡献度说明：

张凤暖：实验设计、实验实施及执笔；高天舒：实验设计、审校。

文章内容不涉及相关利益冲突，该研究未涉及任何厂家或其他经济组织直接或间接经济或利益赞助。