拟康宁木霉T-51菌株对番茄枯萎病的生物防治及其机理研究

王前程，张迎迎，戴陶宇，尤佳琪，郭世荣，朱为民*

(1 南京农业大学 园艺学院，南京 210014；2 上海市农业科学院 园艺研究所，上海市设施园艺重点实验室，上海 201403)

番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum) 引起的维管束疾病，是一种严重危害番茄品质和产量的土传性病害，镰刀菌酸(fusaric acid, FA)被认为是番茄枯萎病发生过程中的一个重要致病因子[1]。番茄幼苗期到成株期均可受到病原菌的侵染，很难彻底根除，因此番茄枯萎病又被称为“番茄癌症”[2]。症状具体表现为植株生长发育不良，比健康番茄植株矮小瘦弱、叶片发黄，植株因严重缺水而叶片枯萎，最终整株植物枯萎死亡[3]。番茄枯萎病常在开花期发病，在盛果期出现植株死亡现象，造成果实减产、品质不佳[4]。近些年来，伴随着番茄集约化种植产业的发展，露天和大棚番茄的枯萎病发生呈现持续上升的趋势，严重制约了番茄的产量和质量。

木霉菌(Trichodermaspp.)是自然界广泛分布的真菌，被普遍应用于作物土传病害的生物防治[5]。真菌寄生和诱导植物防御系统抗性被认为是木霉生物防治的重要机制[6]。研究发现茉莉酸/乙烯信号通路在木霉菌诱导植物抗性中普遍发挥作用[7-8]。也有研究表明，木霉可以通过调控植物激素茉莉酸和水杨酸两个不同的信号通路，进而调节植物的生长发育和激活植物的防御系统[9]。

T-51是一株具有生防潜力的拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)。研究表明T-51菌株显著促进西瓜种子萌发和番茄幼苗生长，并且可以增强番茄对灰霉病的抗病性[10-11]。但T-51菌株对番茄枯萎病的防治工作目前还没有相关报道。本试验采用不同的处理方式和检测手段，对T-51菌株与田间分离获得的尖孢镰刀菌展开体外和体内试验，从而明确T-51菌株对番茄枯萎病的防治效果。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试番茄品种为感枯萎病的樱桃番茄材料‘SHy9’。种子采用常规消毒处理，催芽后播种于育苗盆中，生长3周后供接菌试验。供试病原真菌为尖孢镰刀菌，由本实验室从番茄枯萎病病株上分离获得。供试生防木霉菌是拟康宁木霉T-51，分离自湖北省武汉市油菜田土壤[11]，由上海市农业科学院尤佳琪老师筛选获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号M2015729。

1.2 平板对峙试验

将活化好的T-51菌株和尖孢镰刀菌同时转接到PDA固体培养基(马铃薯 200 g；葡萄糖 20 g； 琼脂15 g)平板上，2块菌饼(5 mm×5 mm)对称分布，相距约7 cm，以单独转接尖孢镰刀菌的平板为对照组，每种处理重复3次，25 ℃恒温培养7 d，采用十字交叉法测量两种菌的生长直径。以T-51对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率评价竞争作用。抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

另外，将活化好的尖孢镰刀菌转接到PDA平板上培养3 d后，再转接T-51菌株，取对峙培养2周后尖孢镰刀菌生长区域的菌饼进行二次转接，培养5 d后观察生长状态并鉴定。

1.3 T-51菌株抑制尖孢镰刀菌最适温度和pH值筛选试验

将对峙培养的平板放置在不同的温度环境(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃)中培养，每一种处理3次重复；调整用于对峙培养的平板中PDA培养基的pH值(3、5、7、9和11)，并在室温条件(25 ℃)下进行平板对峙试验，每一处理3个重复；均培养7 d后按照1.2的测量方法进行记录分析。

1.4 T-51菌株防治番茄苗期枯萎病盆栽试验

首先，进行T-51菌株和尖孢镰刀菌孢子洗脱液的制备。将T-51转接到PDA固体培养基上，22 ℃光照培养3 d，用含有0.05% Tween-20的灭菌水刮洗平板得到洗脱液，过滤菌丝获得孢子液，浓度调整为1×107个/mL，即得到T-51孢子洗脱液。尖孢镰刀菌孢子液制备时平板培养条件为25 ℃黑暗培养，其余步骤同上。T-51和尖孢镰刀菌混合孢子液制备步骤同上，二者终浓度均为1×107个/mL。

其次，对长势健壮的3周龄番茄幼苗洗根，随后把根部分别放入清水和制备好的3种孢子液中浸泡15 min，然后重新栽种到盆中，置于温度25 ℃、相对空气湿度55%～65%下生长，每种处理24株番茄幼苗[12]。3周后调查番茄发病情况，番茄枯萎病参照张素平的分级标准[13]，病情指数参照宗兆锋和康振生[14]的计算方法。根据发病等级计算病情指数和发病率，并在各处理番茄幼苗叶片取样，进行相关指标测定。

病情指数(%)=∑(各级病株数×相应病级)/(总株数×最高病级)×100%。

发病率(%)=该处理发病植株数/该处理植株总数×100%。

1.5 防治试验中叶片相关指标观测

1.5.1 叶绿素荧光参数利用调制叶绿素荧光成像系统(德国 WALZ,IMAG-MAX/L)测定叶绿素荧光参数，测量前将番茄幼苗叶片暗适应15 min，随后对光合系统 Ⅱ(PSⅡ)最大光化学效率(Fv/Fm)、非光化学淬灭系数(non-photochemical quenching, NPQ)、光化学淬灭系数(qP)和表观光合电子传递速率(apparent photosynthetic electron transport rate, ETR)进行测定，每一处理分别选取6株番茄相同部位的叶片，每一叶片避开叶脉随机选取3个测定点。

1.5.2 抗病性相关物质和酶活性对防治试验各处理的番茄幼苗叶片取样，进行过氧化氢(H2O2)含量、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性检测，每种检测重复3次，检测方法均按照苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒说明书操作步骤进行测定。

1.5.3 水杨酸和茉莉酸含量及相关基因表达量对防治试验各处理的番茄幼苗叶片取样，定量测定植物内源激素水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)含量，每种测定重复3次，本试验由南京瑞源公司采用液质联用(LC-MS/ MS)方法测定分析。

同时，对上述材料提取RNA，反转录成 cDNA，进行qRT-PCR表达量分析，每个反应3个重复，相对表达量的计算方法采用2-ΔΔCT法，将目标基因的表达量与内参基因[15]的信号进行归一化。利用引物设计软件Primer5对SA与JA合成及信号转导基因设计引物，引物设计如表1所示。

表1 引物名称及序列Table 1 Primer name and sequence

1.6 数据处理与分析

使用Excel进行数据整理，并利用SPSS对数据进行统计与显著性分析，使用GraphPad Prism 8进行绘图，表型观察拍照使用佳能相机，后期用Photoshop进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 拟康宁木霉T-51菌株对尖孢镰刀菌的抑制作用

平板对峙试验显示，与对照相比，同一PDA平板上转接的T-51菌株随着时间的推移，快速占据生长所需的营养和空间，并且显著限制尖孢镰刀菌菌丝扩展(图1, Ⅰ)。统计分析对峙培养7 d的2种菌的生长半径，发现T-51菌株显著抑制了尖孢镰刀菌的生长直径(图1, Ⅱ)。培养后期木霉菌可在尖孢镰刀菌的菌落上生长，并逐渐覆盖其生长的周边区域；从共培养平板中尖孢镰刀菌菌丝生长区域取下一块菌饼转接到新的PDA培养皿中，培养3 d，观察鉴定培养皿中生长的是T-51菌株(图1, Ⅲ)。说明与T-51平板对峙后的尖孢镰刀菌已没有生长活性，T-51对尖孢镰刀菌有显著抑制作用。

2.2 拟康宁木霉T-51菌株抑制尖孢镰刀菌的最适温度和pH值

为探究拟康宁木霉T-51菌株有效抑制尖孢镰刀菌的最适温度和pH，进行了不同温度和pH下的平板对峙试验(图2)。其中，不同温度环境下T-51菌株和尖孢镰刀菌的对峙培养结果(图2, Ⅰ)显示，随着温度的升高，各时期T-51菌株对尖孢镰刀菌的抑制率均呈现先升高后下降趋势，并均在环境温度为20 ℃时达到最高，且与同期其他温度处理存在显著差异；随着处理时间的增加，各温度处理的尖孢镰刀菌的抑制率均逐渐增加，在处理第7天时分别达到38.65%、63.56%、57.26%、43.13%和15.17%。这可能与拟康宁木霉T-51菌株和尖孢镰刀菌各自生长的最适温度有关。综合分析认为，T-51菌株在20 ℃～25 ℃范围内对尖孢镰刀菌有较显著的抑制效果。

另外，T-51菌株和尖孢镰刀菌在不同pH培养基上对峙试验结果(图2, Ⅱ)表明，在培养基不同酸碱度环境下，T-51菌株对尖孢镰刀菌抑制率变化趋势与温度处理相似，但变化幅度不如温度处理间大；其中，T-51菌株对尖孢镰刀菌在pH为5-11范围内均有抑制效果，在处理7 d时抑制率分别是46.45%、63.53%、56.85%和54.06%，且处理间差异均达到显著水平。这说明T-51菌株在不同酸碱环境下均有较好的抑菌效果，并以pH为7时抑菌率显著较高。

2.3 拟康宁木霉T-51菌株对番茄苗期枯萎病的防治效果

不同处理的番茄幼苗生长3周后出现明显的表型差异，尖孢镰刀菌孢子液处理的番茄幼苗茎基部皱缩，叶片由上至下逐渐发黄枯萎；经混合孢子液处理的番茄植株无明显的感病症状，植株生长状态与对照组的番茄幼苗无显著差异；浸泡T-51孢子液的番茄植株长势健壮，叶色深绿、茎部粗壮、株高较高(图3, Ⅰ)。

进一步统计分析各处理番茄幼苗的发病情况(图3, Ⅱ、Ⅲ)发现，清水处理组和T-51处理组的番茄植株发病率均是0；单独接种尖孢镰刀菌的番茄幼苗发病情况严重，发病率达83.33%，病情指数高达81.25%； T-51菌株与尖孢镰刀菌混合孢子液处理组病情指数降至13.54%，发病率降低为12.5%，与单独接种病原菌组差异显著，相对防效是87.5%。以上结果表明T-51能够有效抑制尖孢镰刀菌，降低番茄枯萎病的发病率和病情指数，提高植株抗病性。

2.4 拟康宁木霉T-51菌株对番茄苗期生理生化指标的影响

首先，叶绿素荧光表型分析结果显示，尖孢镰刀菌处理组番茄叶片明显感病，混合孢子液处理组番茄叶片弱感病，对照组和T-51孢子液处理组的番茄叶片无明显感病状态(图4, Ⅰ)。同时，单施尖孢镰刀菌、施加混合孢子液、清水处理和单施T-51处理的番茄叶片叶绿素荧光参数PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、表观光合电子传递速率(ETR)和光化学淬灭系数(qP)呈现依次递增趋势，而非光化学淬灭系数(NPQ)呈现依次递减趋势；施加混合孢子液处理组番茄叶片的Fv/Fm、ETR和qP与尖孢镰刀菌处理组相比分别显著提高了22.41%、27.19%和39.21%，而其NPQ却显著降低了34.54%，几乎恢复到对照组水平(图4, Ⅱ-Ⅴ)。结果表明，T-51菌株能够有效抑制尖孢镰刀菌的侵染，保护番茄光合系统免受破坏，显著提高幼苗的抗病性和光合能力。

其次，由图5可知，单施尖孢镰刀菌孢子液的番茄叶片中H2O2含量显著高于其他3种处理，施加混合孢子液处理组H2O2含量稍低于对照，单施T-51孢子液处理叶片中H2O2含量最低并显著低于对照；与清水对照相比，单施尖孢镰刀菌孢子液的番茄叶片中CAT和SOD活性显著降低，而其POD活性显著增加，施加混合孢子液和单施T-51孢子液处理的CAT、POD活性显著增加，而SOD活性无显著变化；与单施尖孢镰刀菌孢子液处理组相比，施加混合孢子液和单施T-51孢子液的番茄叶片的CAT、POD和SOD活性均显著升高，其中混合孢子液处理组酶活分别是尖孢镰刀菌处理组的2.58倍、1.64倍和1.16倍。可见，T-51能够显著提高番茄植株体内的抗氧化物酶的活性，清除过量活性氧，提高植株抗枯萎病能力。

2.5 拟康宁木霉T-51菌株对番茄植株内水杨酸和茉莉酸含量及相关基因表达的影响

如图6显示，与对照相比，尖孢镰刀菌处理组番茄幼苗叶片中水杨酸(SA)含量显著大幅升高，而茉莉酸(JA)含量却显著降低，混合孢子液和单施T-51孢子液处理组番茄叶片中的SA和JA含量均有显著升高；与单施尖孢镰刀菌孢子液处理相比，混合孢子液处理和单施T-51孢子液处理番茄叶片中SA含量显著降低，而其JA含量显著升高(图6,Ⅰ、Ⅱ)。

以上结果表明，T-51菌株能有效触发番茄幼苗体内防御系统，引起激素含量显著变化，从而提高番茄幼苗的抗病性。

同时，SA信号通路和JA合成的关键基因表达分析结果显示，与对照相比，单独尖孢镰刀菌孢子液、混合孢子液、单独T-51孢子液处理的番茄幼苗SA信号通路上的PR1和TGA2基因表达量都显著上调，并均以单施尖孢镰刀菌的番茄幼苗上调幅度最大，显著高于其余两处理(图7, Ⅰ、Ⅱ)。同时，单施尖孢镰刀菌孢子液番茄幼苗JA合成基因LoxD的表达量相比于对照组显著下调，而混合孢子液处理组和单独T-51菌株处理组中该基因表达量均显著上调(图7, Ⅲ)。即番茄幼苗中SA信号通路和JA合成关键基因的表达与其激素含量变化趋势结果一致。由此可见，拟康宁木霉T-51可以调节番茄植株内水杨酸和茉莉酸相关基因表达，调控内源激素含量变化，以抵抗尖孢镰刀菌病原菌的侵染。

3 讨 论

木霉菌生防作用机制是多方面的，其对致病菌的重寄生作用是防治病原菌的主要机制之一[16]；另外木霉菌与植物互作改变了植物基因表达水平，使植物获得了对病害和逆境的抗性[5,17]；同时，木霉与植物共生时产生的次生代谢物不仅能诱导植物抗性，还参与对植物碳水化合物代谢和植物生长发育的调控[18-21]；木霉还可以改变植物体内源激素SA和JA的含量从而应答病原菌的入侵[22]，诱导番茄体内抗病基因表达，激活番茄诱导系统抗性(Induced Systemic Resistance, ISR)，从而对番茄枯萎病产生防御能力[23]。目前，利用木霉防治作物枯萎病的研究已有较多报道，主要集中在哈茨木霉、棘孢木霉[24]和绿色木霉[25]等木霉，但有关拟康宁木霉生防枯萎病的报道还相对较少。本研究利用拟康宁木霉T-51菌株防治番茄枯萎病，其生防效果显著，并在生理、激素和基因水平均有所体现。

本研究通过平板对峙试验和苗期接种试验，发现拟康宁木霉T-51菌株对引起枯萎病的尖孢镰刀菌生长有显著的抑制效果，并且在环境温度20 ℃、pH为7～9时对致病菌的抑制效果显著，说明T-51对酸碱环境适应能力强，并且更适用于中低温环境，这一特点更有利于T-51应用于实际栽培生产中番茄枯萎病病害防治。

首先，叶绿素荧光含量反映了植物光合作用的强弱[26]，宋明霞等[27]研究表明绿色木霉与枯草芽孢杆菌混合菌液能够激活番茄光合系统活性，提高光合效率。本试验中，拟康宁木霉T-51菌株通过显著提高番茄幼苗叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm、ETR和qP的同时显著降低NPQ，有效减缓尖孢镰刀菌对番茄叶片中PSⅡ的破坏，从而提高植株叶片的光合能力，保障植株正常进行光化学能量转化。

同时，植物抗氧化酶如 SOD、POD、CAT 等活性与植物抗病性是正相关关系，而H2O2含量与植物抗病性呈现负相关关系。木霉菌能够诱导植物抗病相关防御酶活性发生变化，增强植物体的抗病防御能力[28]。活性氧含量和抗氧化物酶活性是反映植物受胁迫和抗逆能力的重要指标。本研究中T-51菌株处理可以显著提高番茄植株体内防御性酶CAT、POD和SOD活性，降低H2O2含量。H2O2含量越高，氧化胁迫程度越高，对植物体内DNA、蛋白质和细胞器的损伤越大；而POD、SOD、CAT等抗氧化物酶的活性越高，则对活性氧的清除能力越强，抗逆能力越强。以上结果说明T-51菌株通过提高防御性酶活性以抵抗病原菌侵染植株带来的生物逆境胁迫，从而增强番茄植物抗病性。

另外，木霉菌株诱导番茄体内抗病相关基因表达，激活番茄系统诱导抗性，从而对番茄枯萎病产生防御能力[17]。茉莉酸与水杨酸在植物抗病中处于不同的信号通路，SA途径激发植物的系统获得性抗病(systemic acquired resistanc, SAR)通路，而JA/ET信号通路激发的是植物诱导性抗病信号通路[22,29]。研究发现木霉可以激活植株体内茉莉酸通路提高植物的抗病性[30]，哈茨木霉突变体Thc6对玉米叶斑病菌的抗病性研究，发现木霉通过诱导植物茉莉酸依赖性途径增强植物的抗病性[8]。本试验通过测定与植物抗病性相关的两个内源植物激素SA和JA含量发现，当单独用尖孢镰刀菌孢子液处理番茄材料时，其叶片中的SA含量显著上调，JA含量显著下调，而混合孢子液和单施T-51菌株处理的番茄叶片中SA、JA含量与对照相比均上调，但JA上调幅度较大。推测尖孢镰刀菌侵染植株的过程中激活了番茄幼苗SAR信号通路，植株进行自我保护；但SAR途径不是木霉防治枯萎病的主要信号通路，拟康宁木霉T-51菌株主要是通过诱导番茄幼苗调控JA合成，激活植株ISR防御信号通路，从而防治番茄枯萎病。SA和JA相关基因表达水平的变化也证明了这一点。

综上所述，本研究利用生理生化和分子生物学等手段，明确了拟康宁木霉T-51菌株对尖孢镰刀菌引起的番茄枯萎病防治上具有显著的生防效果，该菌株是对番茄枯萎病具有生防潜力的菌株，该工作为研发番茄枯萎病生物防治制剂提供了优良菌株和可靠的理论依据。