6个山黧豆品种的β-ODAP含量与蛋白酶抑制剂活性及其关系分析

付 筱，宋瑶瑶，陈 红，徐全乐*

(1 河南省济源市林业工作站，河南济源 459000；2 西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨陵 712100)

山黧豆(LathyrussativusL.)富含蛋白、具有优良而广谱的抗逆性[1-2]，是中国定西等西部干旱、半干旱地区的重要农作物选择[3]，也是对抗亚太地区等存在的“隐性饥饿”、丰富农作物系统等的优良种质资源[4]。然而，山黧豆的过量摄入会导致抗营养因子β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid，β-ODAP)通过α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate，AMPA)型谷氨酸受体作用于大脑皮层神经系统，造成人畜运动神经元损伤性疾病[5]。该病多见于以山黧豆为主要食物来源超过3～4个月，被称为神经性山黧豆中毒[1,6]。孟加拉(1980s)、印度(1980s)、埃塞俄比亚(1980s、1990s)和中国甘肃(1970s)等均曾发生过大规模的山黧豆中毒事件[3]。在国内外山黧豆科研工作者的不懈努力下，低毒山黧豆品种培育已成为利用乡土植物资源的成功范例[7]。

除了β-ODAP的生物合成调控与毒理学研究之外，蛋白酶抑制剂等其他类型抗营养因子的调控机理研究也是山黧豆品质改良和遗传育种研究的主要方面[8]。而且，在将山黧豆作为动物饲料时，蛋白酶抑制剂等的负面影响远远大于β-ODAP[9]。在山黧豆中，蛋白酶抑制剂KTi(Kunitz trypsin inhibitor)和BBi(Bowman-Birk inhibitor)均已被分离和鉴定[10-11]，且氨基酸序列与其他豆科作物的KTi和BBi序列高度保守[12-13]。Xu等[13]检测了51种山黧豆的KTi和BBi活性表明，山黧豆KTi具有胰蛋白酶抑制剂活性(trypsin inhibitor activity，TIA)，BBi同时具有TIA和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性(chymotrypsin inhibitor activity，CIA)；并从中筛选到了一个巴西山黧豆品种具有较低的KTi和BBi活性，为进一步的品种选育奠定了基础。

KTi中的Cys含量较低，但山黧豆BBi仅110个氨基酸的序列中含有14个Cys残基，可以做为胞内硫的储存形式[13-14]。由于β-ODAP的生物合成与Cys代谢、硫代谢等密切相关[8, 15-16]，并和Cys的合成竞争共同底物O-乙酰丝氨酸[16]，半胱氨酸合成酶作用导致的O-乙酰丝氨酸消耗和Cys积累可能限制β-ODAP的合成，并促进BBi等含硫氨基酸丰富的下游产物积累。实际上，半胱氨酸合成酶基因在大豆中的过表达确实引起了BBi积累水平的增加[17]。这为研究β-ODAP与KTi、BBi生物合成，硫代谢平衡之间的关系及调控，对山黧豆的品质改良研究及进一步筛选低抗营养因子种质提供了重要依据。本研究分析了家山黧豆(L.sativus)、扁荚山黧豆(L.cicera)等6种山黧豆种子的TIA和CIA，β-ODAP含量及相关酶活等，通过相关性分析等解析了山黧豆抗营养因子β-ODAP与KTi、BBi活性之间的关系，为山黧豆品质形成调控机制研究、种质资源深度评价以及优良品系的筛选奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

家山黧豆(LathyrussativusL.)、扁荚山黧豆(L.ciceraL.)、阿富汗山黧豆、保加利亚山黧豆、埃塞俄比亚山黧豆、土耳其山黧豆种子由西北农林科技大学山黧豆课题组保存并提供，按顺序分别编号为1～6。

1.2 方 法

1.2.1 不同山黧豆种子蛋白的SDS-PAGE分析取不同山黧豆种子干粉15 mg，用1 mL 1×TBS缓冲液在室温下浸提15 min。6 000 r/min离心10 min后取上清200 μL，添加200 μL 2×SDS缓冲液和3% β-巯基乙醇煮沸5 min，利用12.5% SDS-PAGE进行可溶性蛋白分析。

取不同山黧豆种子干粉50 mg，用800 μL 30%乙醇室温下浸提30 min。6 000 r/min离心10 min后取上清500 μL，加3倍体积丙酮在-20 ℃过液沉淀。14 000 r/min离心10 min后，取沉淀加200 μL 1×SDS 缓冲液和3% β-巯基乙醇，煮沸5 min后利用12.5% SDS-PAGE进行醇溶蛋白分析。

1.2.2 胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性检测参考Xu等[13]方法进行胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性检测。称50 mg山黧豆种子粉末，用1 mL Tris-HCl(50 mmol/L，pH8.0)在室温下提取10 min；15 000×g离心10 min后取上清备用，利用考马斯亮蓝法检测蛋白含量[18]。

胰蛋白酶抑制剂活性检测反应体系包含50 mmol/L Tris-HCl(含20 mmol/L CaCl2-2H2O)940 μL，胰蛋白酶(1 mg/mL)和种子提取液各20 μL。将反应体系置于37 ℃水浴15 min后添加1 mmol/L的N-苯甲酰基-DL-精氨酰对硝基苯胺盐酸盐(α-N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride，BAPNA)20 μL继续反应10 min，用500 μL 30%乙酸终止反应，在410 nm下检测吸光度值。

胰凝乳蛋白酶抑制剂活性检测反应体系包含50 mmol/L Tris-HCl(含20 mmol/L CaCl2-2H2O)890 μL，胰凝乳蛋白酶(2 mg/mL)40 μL，种子提取液 50 μL。反应体系置于37 ℃水浴15 min后再添加1 mmol/L戊二酰-L-苯丙氨酰-对硝基苯胺(N-glutaryl-L-phenylalanine-4-nitroanilide，GLUPHEPA)20 μL继续反应45 min，用500 μL 30% 乙酸终止反应，在410 nm下检测吸光度值。

胰蛋白酶抑制剂活性和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性用每毫克蛋白的抑制剂单位(inhibitor units，IU)表示，分别表示为TIU和CIU。抑制剂单位定义为吸光度值减小的100倍。抑制剂活性表示为平均值±标准差，利用SPSS 16.0软件中的LSD法进行差异显著性分析。

1.2.3 β-ODAP含量分析参考Jiao等[19]方法进行β-ODAP含量分析。分别取山黧豆种子0.5 g，用5 mL NaHCO3(0.5 mol/L，pH 9.0)充分研磨。12 000 r/min、4 ℃离心后，取上清100 μL，加等体积2,4-二硝基氟苯于65 ℃衍生化30 min。室温冷却后加入800 μL磷酸缓冲液(1/15 mol/L，pH 6.89)，于12 000 r/min离心5 min。取上清经0.22 μm滤膜过滤，利用Waters Alliance全自动高效液相色谱仪(Symmetry C18色谱柱)进行β-ODAP含量检测。检测柱温40 ℃，流速1 mL/min，检测波长360 nm，流动相为17%乙腈。以β-ODAP标准品(Sigma)系列浓度绘制标准曲线。

1.2.4 丝氨酸乙酰基转移酶和β-腈基丙氨酸合成酶活性检测参考Song等[20]方法进行丝氨酸乙酰基转移酶(serine acetyltransferase，SAT)和β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase，CAS)活性检测。

SAT活性检测反应体系包含50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L乙酰辅酶A，2 mmol/L丝氨酸，0.1 mL酶液。反应体系置于37 ℃反应20 min后，用50 μL的6 mol/L盐酸胍终止反应。利用5,5′-二硫双硝基苯甲酸(50 μL)显色10 min后于412 nm处检测吸光值。以系列已知浓度的辅酶A为标准曲线。酶活力单位(U)定义为：37 ℃下，每毫克蛋白在上述反应条件下每分钟催化反应生成CoA的含量。

CAS活性检测反应体系包含70 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L Cys，0.75 mmol/L KCN，0.1 mL酶液。反应体系置于30 ℃反应30 min，继续加入甲基兰前体染色液Ⅰ和Ⅱ各0.2 mL反应20 min，并于665 nm处检测吸光值。以系列已知浓度梯度的Na2S为标准曲线。酶活力单位(U)定义为：30 ℃下，每毫克蛋白在上述反应条件下每分钟催化反应生成S2-的含量。

1.2.5 本地转录组数据库中几种抗营养因子相关基因表达水平的相关性分析从本实验室前期所测的家山黧豆不同组织[播种后2 d(days after sowing，DAS)种子、6 DAS幼苗、25 DAS叶片]的转录组分析数据库(SRP145030)[21]中获得山黧豆抗营养因子KTi、BBi基因及β-ODAP合成关键基因SAT和CAS表达量，利用SPSS 16.0计算各基因表达水平的皮尔逊相关系数。

2 结果与分析

2.1 6个山黧豆品种的种子蛋白特征

6个山黧豆品种的种子在色泽、大小等方面表现出显著的形态差异(图1)。其中，家山黧豆和保加利亚山黧豆的种子呈白灰色，其余种子呈褐色；在种子大小方面，以扁荚山黧豆的种子最小，其余山黧豆品种的种子大小相当。考马斯亮蓝G250染色法检测显示，6种山黧豆种子(1～6号)的可溶性蛋白含量依次为23.04%、22.76%、19.16%、28.46%、30.93%和23.52%。

为了研究不同山黧豆种子的蛋白质组成差异，分别进行了醇溶蛋白和可溶性蛋白的提取及SDS-PAGE分析。在30%乙醇提取的蛋白组分中，表观分子量为14～18 kD的蛋白丰度最高，其次为110、50、42和30 kD蛋白(图2，A)。在不同的山黧豆品种之间，42 kD蛋白广泛存在，但醇溶蛋白的丰度和大小也呈现明显的差异。例如扁荚山黧豆种子蛋白在50、30 kD与家山黧豆呈现显著差异，保加利亚山黧豆在50 kD呈现特征条带(图2，A)。

对可溶性蛋白组分的SDS-PAGE分析显示，表观分子量在35～66 kD之间以及20 kD的蛋白丰度较高(图2，B)。其中，山黧豆47 kD蛋白β-lathyrin广泛存在于6个山黧豆品种中，在扁荚山黧豆的积累水平明显较高，在其余山黧豆品种中的表达量基本一致(图2，B)。此外，扁荚山黧豆缺乏42和56 kD蛋白等，且在25 kD处具有特征条带(图2，B)。这些结果表明，山黧豆种子蛋白的SDS-PAGE分析可能是作为山黧豆不同品种遗传多样性研究的有效方法。

2.2 6种山黧豆种子的蛋白酶抑制剂活性特征

为了分析不同山黧豆种子中的蛋白酶抑制剂活性差异，利用Tris-HCl缓冲液提取物检测了胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性。结果表明，不同山黧豆种子的胰蛋白酶抑制剂活性介于100～190 TIU之间(图3，A)，胰凝乳蛋白酶抑制剂活性介于5～9 CIU之间(图3，B)。说明山黧豆中的蛋白酶抑制剂以胰蛋白酶抑制剂为主。

此外，家山黧豆、土耳其山黧豆表现出较高的胰蛋白酶抑制剂活性，扁荚山黧豆、阿富汗山黧豆和埃塞俄比亚山黧豆表现出较低的胰蛋白酶抑制剂活性(图3，A)。家山黧豆、保加利亚山黧豆表现出较低的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，土耳其山黧豆表现出较高的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性(图3，B)。

2.3 6种山黧豆种子的β-ODAP含量分析及相关酶活性检测

利用HPLC分析表明，扁荚山黧豆的β-ODAP含量最低，其次为家山黧豆；土耳其山黧豆的β-ODAP含量最高(图4)。进一步检测β-ODAP生物合成关键酶活性表明，家山黧豆具有较高的CAS和SAT活性；其他山黧豆的CAS活性基本相当，没有显著差异。令人感兴趣的是β-ODAP含量最高的土耳其山黧豆也具有最高的SAT活性，β-ODAP含量最低的扁荚山黧豆具有最低的SAT活性(图4)。这暗示了SAT活性与β-ODAP含量之间的相关性。6种山黧豆SAT活性与β-ODAP含量的相关性分析表明，二者呈弱相关(r=0.29)。但是在除去家山黧豆之后，SAT活性与β-ODAP含量之间的相关系数增加到0.76，呈显著正相关。这可能是由于家山黧豆SAT主要分布于细胞质，参与Cys而不是β-ODAP的生物合成，导致家山黧豆在表现为较高的总SAT活性情况下，具有较低的β-ODAP含量。

聚类分析显示，家山黧豆和扁荚山黧豆聚在一支，阿富汗山黧豆和埃塞俄比亚山黧豆聚在一支，与土耳其山黧豆的亲缘关系较远。

2.4 山黧豆蛋白酶抑制剂和β-ODAP合成关键基因的相关性分析

KTi和BBi是山黧豆中的2种重要的蛋白酶抑制剂。在山黧豆种子萌发期不同组织的转录组学分析数据库(SRP145030)中比对到2条KTi基因(KTi1、KTi2)、1条BBi基因(BBi1)，以及β-ODAP合成关键基因SAT基因(SAT1、SAT2、SAT3)3条、CAS基因1条。这些基因在山黧豆种子萌发过程中均有表达(图5，A)。皮尔逊相关性分析表明：KTi2与BBi1基因的表达水平具有强正相关性(r=0.97)；KTi1与SAT1、SAT2基因的表达水平具有强负相关性(KTi1-SAT1：r=-0.99；KTi1-SAT2：r=-0.99)，KTi2、BBi1与SAT3基因的表达水平具有强负相关性(KTi2-SAT3：r=-0.90；BBi1-SAT3：r=-0.97)；SAT1、SAT2与CAS基因的表达水平具有强负相关性(SAT1-CAS：r=-0.89；SAT2-CAS：r=-0.89)。

3 讨 论

通过种质资源评价与筛选，获得具有较高含硫氨基酸含量、较低β-ODAP含量与蛋白酶抑制剂活性品种是山黧豆品质相关基础研究的重要方面[3,8]。研究表明，β-ODAP的生物合成途径和Cys代谢、硫代谢等基础代谢途径密切相关[8, 15-16]，可通过沉默或敲除β-ODAP生物合成关键酶基因，在降低β-ODAP含量的同时提升Cys等含硫氨基酸含量，进而改善山黧豆营养品质[8, 22-23]。Xu等[13]对来自阿富汗、埃塞俄比亚、巴西、印度等全球24个国家的51个山黧豆不同品种进行了TIA和CIA活性检测，从中筛选到了一个巴西山黧豆品种具有较低的KTi和BBi活性，为进一步的品种选育奠定了基础。然而，大部分相关研究仅聚焦于β-ODAP代谢或蛋白酶抑制剂活性等。因此，针对抗营养因子β-ODAP与蛋白酶抑制剂活性、硫代谢平衡之间的关系及调控研究将对山黧豆品质的全面改良研究及进一步筛选低抗营养因子种质提供重要依据。

通常，山黧豆种质资源评价与筛选采用形态、产量、品质等性状指标[24-27]。扩增片段长度多态性(AFLPs)、随机扩增多态性DNA(RAPD)和限制性片段长度多态性(RFLP)、单核苷酸多态性(SNP)等分子标记手段也被用于山黧豆属内的遗传变异研究[28]。此外，Przybylska等[29-30]利用SDS-PAGE分析了种子清蛋白和球蛋白的种内变异情况，Yunus等[31]利用淀粉凝胶电泳检测了6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、过氧化物酶等6种酶在52个山黧豆品种中的多态性。本研究通过对山黧豆醇溶蛋白和可溶蛋白电泳条带特征的分析进一步证实，SDS-PAGE是山黧豆品种遗传多样性研究的重要手段[13]。而且，47 kD过敏原蛋白[32]等已鉴定的山黧豆品质相关蛋白质条带的分布特征，可能作为山黧豆种质资源鉴定与深度评价的重要方法。

山黧豆的TIA活性低于大豆，但高于其他食用豆[33-35]。本研究结果表明，山黧豆的胰蛋白酶活性介于100～190 TIU、胰凝乳蛋白酶活性介于5～9 CIU，与Xu等[13]报道基本相符。β-ODAP合成关键酶活检测表明，SAT与β-ODAP含量呈显著正相关，是β-ODAP生物合成的限速酶[20]。进一步利用本地转录组数据分析β-ODAP生物合成关键基因与蛋白酶抑制剂相关基因表达量关系表明，二者呈显著负相关。但是，β-ODAP含量和蛋白酶抑制剂活性的相关性较小(β-ODAP-KTi：r=0.09；β-ODAP-BBi：r=0.31)，这可能是在β-ODAP含量和蛋白酶抑制剂活性调控及平衡中存在转录后调控方式。例如，SAT与CAS形成半胱氨酸合成酶复合物调控二者酶活是β-ODAP生物合成调控的典型特征[20]，磷酸化修饰也会影响SAT酶活[36]。在山黧豆中，β-ODAP和Cys的生物合成需要竞争O-乙酰丝氨酸[16]。在半胱氨酸合成酶基因作用下，O-乙酰丝氨酸的利用和Cys积累对于SAT的反馈抑制限制了β-ODAP的合成[3, 20]，并可能促进BBi等含硫氨基酸丰富的下游产物积累。因此，在转录水平阻断β-ODAP和BBi生物合成的同时，有望改善山黧豆的含硫氨基酸水平，全面提升山黧豆营养品质。

综上所述，本研究利用SDS-PAGE、酶活检测和相关性分析等方法对家山黧豆、扁荚山黧豆等6个山黧豆品种的蛋白酶抑制剂活性、β-ODAP含量及二者之间的关系进行了分析，结果表明β-ODAP与BBi生物合成之间呈显著负相关。这为进一步研究山黧豆中β-ODAP和BBi生物合成调控，改善山黧豆的含硫氨基酸水平等奠定了基础。