宁夏枸杞的花粉呈现式样及交配系统研究

哈里布努尔，热依拉穆·麦麦提吐尔逊，艾沙江·阿不都沙拉木,2*

(1 喀什大学 生命与地理科学学院, 新疆喀什 844000；2 新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆喀什 844000)

被子植物的花大小、花颜色、花回馈(花蜜、花粉和花气味)和雌雄蕊器官异熟、异位程度及花寿命、花药开裂和花粉散粉时间等表现的花部综合征(花设计和花展示)，通过传粉者活动、花粉散粉过程、雌雄功能干扰及交配方式来影响雌雄繁殖成功程度[1-4]，其中的雄性繁殖受到花回馈、传粉者类型和效率以及花粉呈现的影响。

传粉效率(雄性适合度)是推动植物花部特征进化的重要驱动力[5]。有花植物在更多的资源投入(花粉数量)和调整花粉呈现时序(花粉散粉方式)来提高雄性繁殖及适合度[6-8]，其中的花粉呈现过程式不仅提高花粉传递效率、避免雌雄功能干扰及减少雄性竞争来保障雄性适合度(花粉移出)，而且可增加植物对环境变化的适应能力来保障雌性繁殖成功[9-11]。花粉呈现过程不仅受到植物花部特征的影响，还受到传粉者类型和效率(高移出高沉积、高移出低沉积、低移出高沉积及低移出低沉积4种类型)的影响。在传粉者充足的情况下植物通过花粉逐步呈现(花粉从花药、花或花序上逐次被释放，使传粉者依次移出花粉)吸引更多的传粉者来减少被一次移出的花粉，避免花药间的干扰，提高雄性繁殖及适合度[7,12-15]，反而在极端环境下(早春低温、沙尘暴及暴雨等)传粉者稀少时, 植物通过同时呈现(花粉同步和较快的速度散出)来增加传粉者一次访花带走的花粉量来避免雄性资源浪费[7,13-14,16-17]。在花寿命短、访花频率和传粉者效率低的异花传粉植物中，花粉逐步呈现是降低花粉限制、提高雄性适合度及异交，保障雌性繁殖的最佳策略[18-19]。

有花植物的雌性繁殖通过不同的交配方式来实现。已报道的交配方式有自主自交(Autonomous autogamy)、辅助自交(Facilitated selfing)及闭花受精(Cleistogamy)、异交和混合交配等类型[20-23]，其中异交为主的交配系统能产生杂种，增强后代活力，避免自交衰退，促进物种的遗传多样性，但该类群的雌性繁殖成功受到花粉呈现及传粉者效率相关雄性繁殖水平的影响。至今，在中国暖温带荒漠环境分布的植物雌雄繁殖的关系相关研究很少报道，本研究以主要分布在宁夏、新疆及内蒙古等干旱和荒环境分布的药用植物宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)为研究材料，对该物种在喀什自然种群的花粉呈现机制与交配系统的关系进行了研究，以期探讨花粉逐步呈现的适应性及其在提高雌雄繁殖过程中的意义。

1 材料和方法

1.1 研究材料与研究地点

宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)为茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)的药用经济植物，中国只在宁夏、新疆、内蒙等干旱和半干旱地区分布的特有种。该物种的花为两性花，花为筒状花；花萼窄钟状，花冠紫色或蓝紫色，花瓣和雄蕊均5个，雄蕊着生于花冠筒口；传粉方式为虫媒传粉[24]。

本研究在新疆喀什市野生宁夏枸杞自然居群中进行(39°28′ N，75°59′ E；海拔1 200～1 280 m)，该区域春季沙尘暴较多，夏季高温，年平均气温12 ℃，年均降水量70 mm，年均沙尘暴天数(24±7) d，气候类型属于典型的暖温带荒漠气候。本研究所有实验在2019-2020年的6月至9月开展。

1.2 研究方法

1.2.1 开花式样与花部特征为检测宁夏枸杞开花式样的特点，在居群盛花期，随机选取即将开放及发育良好的20朵花，观察并记录每朵花的寿命及其在不同时间段的花颜色和雌雄阶段持续时间。在居群花期内，从10株同一位置上随机选取各2朵花，带回实验室，使用便携式SE-2000型数显电子游标卡尺(桂林迪吉特电子有限公司, 桂林, 中国; 精度为0.02 mm)，测量每朵花的花冠口直径、花冠筒长度、花冠筒直径、花瓣长宽、花萼长宽。同时从不同个体中选取发育状态一致即将开放的50朵花，在每个花药开裂阶段选取10朵花，用游标卡尺测量其各阶段每个雄蕊与雌蕊的长度。

1.2.2 性分配特征及花粉呈现式样于宁夏枸杞不同个体中随机选取刚开放(花药未开裂)的20朵花，每朵花的花药放在离心管中，加入2 mL水充分摇匀制成花粉溶液，使用微量进样器取5 μL分5次滴于载玻片上，在Motic B1型光学显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司, 厦门, 中国)下统计花粉数量，每朵花重复6次；同时每朵花的子房在Nikon SMZ-1000型解剖镜(Nikon corporation, Tokyo, Japan)下解剖并统计胚珠数，计算每朵花的P/O(花粉数/胚珠数)。

在宁夏枸杞盛花期内，从10个不同个体中随机选取40朵即将开放的花，观测记录：(a)花完全开放到花药开始开裂所需时间；(b)每一朵花不同位置花药散粉所需时间；(c)每一朵花所有花药完全开裂所需时间。同时在每朵花每个花药开裂20 min后将已开裂的花药取回，放入离心管压碎后，加入0.5 mL水充分摇匀，使用5 μL微量进样器分5次滴于载玻片上，每朵花重复3次，在Motic B1型光学显微镜下统计剩余花粉数量，计算花粉移出率。在自然种群中随机选取10朵即将开放的花，将各花的花药及柱头置于EP管中自然晾干后，用电胶将样品粘贴在标本台上，用真空镀膜仪(MSP-2S, IXRF Systems, 日本)镀膜后，放入扫描电镜(FEI, Quanta250, 美国)观察花粉和花柱形态并采集图像。

1.2.3 花回馈和传粉特性(1)花回馈及花气味的测定：为了检测宁夏枸杞花雄雌性阶段的花蜜量，在盛花期随机标记将要开放的40朵花并套网袋，在花雄雌性阶段快结束时，用2 μL的毛细管(上海积裕实验室设备有限公司, 上海, 中国)对标记花的花蜜分泌量进行测量。同时，从不同个体随机选取雄雌阶段花各70朵，放入20 mL顶空瓶内，并用压盖器封紧瓶盖，室温放置2 h使花气味充分散发，用Portable Electronic Nose PEN3型电子鼻(Airsense Analytics, Schwerin, Germany)检测花气味中的化学成分，检测时间调至60 s,传感器自动清洗时间调至120 s，Connectvial倒计时提示1 s时，同时将进样针和补气针插入顶空进样器至瓶身2/3处，开始检测挥发性物质，当Removevial倒计时提示1 s时迅速拔出进样针和补气针，停止检测，重复检测3次，并计算每种化合物占总化合物含量的百分比及不同阶段芳香物质含量的变化。

(2)访花行为及传粉者效率：在观测点晴朗的天气里，随机标记当天开放的10朵花，每天8:00-20:00间内 (30 min/h，总240 min/d)，观测宁夏枸杞的昆虫访花频率及停留时间；同时用昆虫网捕获昆虫，致死后，通过昆虫携带的花粉与宁夏枸杞的花粉比较观察, 判断其是否为传粉者，并鉴定昆虫种类。依照Han等[25]的方法，花被一次访花后，取回其花药和柱头，带回实验室，在Motic B1型光学显微镜下统计其从花药移出和沉积到柱头上的花粉量；参考Harder等[13]的公式(g)=logRD来计算传粉者效率(Pollinator efficiency)，其中的g是传粉者效率，R是被昆虫移出的花粉数，D是柱头沉积的花粉数。

1.2.4 自交亲和性和花粉限制的判断在宁夏枸杞盛花期，从10个个体中随机标记发育状况一致即将开放的120朵花，在花开放时，进行以下处理 (每个处理30朵花)：(1)自然授粉。不去雄、自然开放式授粉；(2)去雄人工异花授粉。在花刚开放(花药未开裂)时去雄，并用异株花粉来进行人工授粉；(3)自发自交(主动自交)。在花即将开放时直接套袋；(4)人工自花授粉。在花即将开放时套袋，花药开裂时用自花花粉进行人工授粉。果实成熟时统计不同处理花的座果率及结籽率。参照Zapata等[26]的方法判断自交亲和性，SI=ssi/sso(ssi是人工自花授粉后的结籽率，sso是人工异花授粉结籽率)。同时，参照Castro等[11]的方法计算传粉者限制(PL)：PL= [(PX-PE)×100%]/PX，PX指去雄人工异花授粉花的结籽率，PE是指自然传粉花的结籽率。

1.3 数据分析

所有的数据分析在SPSS 22.0，分析前，用Explore命令花设计、花展示、授粉实验不同处理的结实结籽率以及传粉昆虫在不同时间段的访花频率、停留时间进行正态性检验。对服从正态分布的数据，选用One-way ANOVA检验进行方差性分析。利用广义线性模型(generalized linear model, GLM)，授粉实验不同处理的结实结籽率用正态分布模型-恒定函数进行分析。统计数据以平均值±标准误 (Mean±SE) 表示，作图使用Sigma Plot 10.0软件。

2 结果与分析

2.1 开花特性与花部特征

自然居群中，宁夏枸杞的种群花期为90 d左右。大部分花在上午11：00左右开花，单花寿命为(4.07±0.15)d，其雌性(4±0.01)d比雄性阶段(0.07±0.01)d长，雌雄阶段持续时间存在显著差异(F=288 495.17,P<0.001)。花冠口直径为(12.17±0.50)mm，花冠筒长度和直径分别为(6.22±0.31)mm和(2.86±0.12)mm，花瓣长宽分别为(5.84±0.27)mm和(3.94±0.14)mm，花萼长宽分别为(4.70±0.21)mm和(2.77±0.10)mm；花寿命不同阶段的雌蕊长度均比雄蕊长度长，且二者在不同阶段的长度间存在显著差异(F雄性=32.01,P<0.001；F雌性=133.07,P<0.001; 图1，A-F； 图2，Ⅰ)，雌雄蕊空间位置属于探头式雌雄异位；花柱在雄性阶段弯曲，而雌性阶段回正(图1)。花在雄性阶段花瓣为鲜艳的紫色(图1，A-E)，而雌性阶段的花瓣颜色为淡紫色(图1，F)，花粉形态为椭圆形，花粉外壁具有不规则的条纹(图1，G)，柱头表面有明显的乳突细胞(图1，H)。

2.2 性分配特征及花粉呈现式样

宁夏枸杞单花花粉量为(4 6980±3 833)粒,胚珠为(20.40±1.33)个, 花粉胚珠比(P/O值)为(2 448.11±448.32)，属于兼性异交繁育系统类型。该物种花药在花开放(21.77±6.38)min后开始开裂；5枚花药的开裂方式比较稳定，从柱头弯曲位置靠近的花药开始顺时转逐步开裂；单个花药开裂所需时间为(12.41±0.83)min，5枚花药开裂所需总时间(94.15±7.47)min；不同花药开裂所需时间间存在差异(F=3.43,P=0.015)，第1个花药到第5个花药开裂所需时间逐渐延长(图2, Ⅱ)，属于逐步呈现类型。此外，不同花药开裂间隔时间之间存在显著差异(F=20.062,P<0.001)，其中第1、2及3花药在开裂所需时间上有一定的相互重叠(图2，Ⅲ)，反而第4和第5个花药开裂所需时间上完全隔离；说明每个花药的花粉散粉时间及雄性功能间存在一定干扰现象。每个花药开裂时花粉被昆虫转移，第1花药(89.16%±0.93%)到第5个花药(85.78%±2.46%)被昆虫带走的花粉逐步减少，但后一个花药开裂时从前一个花药被移出花粉率间无显著差异(F=5.729,P=0.22；图2，Ⅳ)，从每个花药后一个花药开裂前被移出的花粉率均达到(88.23%±0.84%)，说明花粉逐步呈现会促进花粉的有效散粉。

2.3 花回馈及传粉特性

(1)花回馈和花气味：宁夏枸杞的花报酬是花蜜、气味和花粉。花在雄性阶段分泌的花蜜量(0.53±0.08) μL比雌性阶段(0.29±0.04) μL多，且二者间存在显著差异(Wald χ2=6.599,P=0.01)。花在雌雄阶段均分泌10大类化合物，其中有4类为芳香类化合物；花在雌性阶段分泌的各化合物含量往往比雄性阶段高(表1)；雌性阶段(34.37%±0.21%)的芳香类物质含量比雄性阶段(31.82%±0.15%)高，且二者之间存在显著差异(F=99.21,P=0.001)。

表1 宁夏枸杞花雄性阶段和雌性阶段花气味中的化学成分占总化合物百分比的比较Table 1 Comparison of chemical components in percentage of total compounds (mean±standard error) between male and female stages flower of L. barbarum

(2)访花行为及传粉者效率:宁夏枸杞在自然居群的访花昆虫有意大利蜜蜂(Apismellifera)、熊蜂(Bombussp.)、食蚜蝇(Syrphidaesp.)、蚂蚁 (Tetramoriumsp.)及苍蝇 (Syrphidfly)等5种。其中意大利蜜蜂、熊蜂和食蚜蝇的身上有该物种的花粉，均为传粉者；蚂蚁为盗蜜者，苍蝇为访花者。3种传粉者雄性阶段的访花频率(1.44±0.36)比雌性阶段高(0.13±0.04)，且存在显著差异(F=13.44,P<0.01)(图3，A)。主要传粉者熊蜂和食蚜蝇一次访花后移走的花粉数之间存在显著差异(F=8.344,P=0.008)，但二者一次访花后沉积的花粉 (F=0.52,P=0.483)和传粉者效率(F=0.23,P=0.64)间未存在显著差异(表2)，熊蜂和食蚜蝇的传粉者效率属于高移出低沉积传粉者类型。

表2 不同传粉者一次访花后的花粉传递效率Table 2 Total number of removed, deposited pollen grains and pollinator efficiency with different pollinators

2.4 自交亲和性和花粉限制

宁夏枸杞不同授粉处理下的座果率(Wald χ2=878.66,P<0.01)和结籽率(Wald χ2=388.27,P<0.01)间均呈显著差异(表3)，其中人工异花授粉花的座果率及结籽率均高于自然授粉花；自发自交座果率为0，说明该物种未存在主动自交现象；此外，人工自花授粉花的座果率(7.82±3.72)及结籽率(5.93±0.91)，自交不亲和指数为0.07，属于自交不亲和植物类型；交配方式属于兼性异交。宁夏枸杞在喀什的自然居群中存在较高的花粉限制(40.71%)。

表3 不同处理授粉对宁夏枸杞结实和结籽率的影响(n=30)Table 3 Effect of pollination treatments on percent fruit-set and seed-set per fruit in the L. barbarum (n=30)

3 讨 论

3.1 雌雄功能的干扰及花粉呈现式样

植物的花部特征不仅影响其对传粉者的吸引和花粉散布，还与传粉机制和植物适合度有着紧密的联系[27-28]。对于虫媒传粉植物的雄性适合度可能会随着植物一次提供更多的花粉而降低[14,29]，因此虫媒传粉的大多数植物通过花粉逐步呈现来提高雄性繁殖[7,10]；如在虫媒传粉植物Bomareaacutifolia通过6枚雄蕊依次开裂的逐步呈现来提高花粉移出率[30]，而Erythroniumgrandiflorum及草地老鹳草(GeraniumpratenseL.)通过内外轮雄蕊逐步呈现来避免雌雄功能干扰[31-32]；此外，在传粉者缺乏的环境中黑鳞顶冰花(Gageanigra)通过逐步呈现来延长散粉时间，降低雄性资源(花粉)浪费[33-34]。本研究表明，宁夏枸杞在花寿命内雌蕊长度往往比雄蕊长度长，属于柱头探出式雌雄异位类型，雄性阶段持续时间比雌性阶段短，雄雌阶段的花粉移出和沉积率上表现出彼此间的权衡关系；说明该物种在长期适应西北地区荒漠环境过程中，雌雄功能在时间和空间上进化出了避免干扰机制。该物种花药在花开放20 min后开始逐步散粉，不完全的逐步呈现(花粉散粉具有一定的同步性)来完成每个花药的雄性繁殖，但花药开裂及散粉时间上存在相互干扰；并且花药散粉的同步呈现提高花药间的雄性功能干扰程度。

花粉在花和花序内的延长散粉时间和交错呈现是一种进化策略，保障其最大限度地输出花粉和雄性繁殖成功[12,35]；虫媒传粉的植物中花回馈和传粉者效率是影响雄性繁殖的主要因素[36]；其中花回馈的时间性变化不仅影响传粉者活动，还能影响花粉的移出和沉积过程[12]。宁夏枸杞雌雄性阶段花回馈(颜色、花蜜、花粉及气味)间存在显著差异；花短时间的雄性阶段(1.5 h)内分泌更多的花回馈(紫色的花色、花蜜及花粉)及分泌一定的芳香物来吸引传粉昆虫，通过花粉的不完全逐步呈现的策略，促进大部分(85%)花粉的迅速移出；反而在漫长的雌性阶段(94 h)，通过分泌更多的芳香物质来吸引昆虫，但极少的花回馈(花蜜和花粉)不仅降低访花频率，还影响花粉同步呈现的展现过程(仅有10%的花粉被移出)。同时，该物种高移出低沉积的两种主要传粉者在花回馈丰富雄性阶段对花粉逐步呈现的成功有重要贡献；花回馈相关的传粉者活动对花粉同时呈现的实现没有作用。此外，低沉积的传粉者在雄性阶段柱头沉积的花粉(81.60±9.34)比雌性阶段(29.13±4.37)多，说明访花频率不仅影响花粉移出还能影响花粉的沉积[12]。花回馈的时间性变化及两种主要传粉者的高移出低沉积效率只促进该物种花粉的移出率，但对花粉的沉积没有起到促进作用。虫媒传粉植物花粉的呈现格局往往是植物开花式样、花部特征以及传粉者效率和环境等多种因素共同作用的结果[37-38]。因此该物种花粉不完全逐步呈现、雌雄空间异位等花部特征是在长期适应西北地区荒漠环境(强沙尘暴、夏季高温、荒漠气候)过程中为了保障雄性繁殖、提高物种遗传多样性表现出的进化机制，该物种在不同的生境花粉呈现可能有不同的散粉机制，有待进一步的研究。

3.2 交配方式和花粉限制特征

动物传粉植物的花部综合征不仅影响其对传粉昆虫的访花行为、花粉散粉过程[27, 39]，而且影响植物的交配方式及雌雄适合度[8]。按照Dafni[40]和Cruden[41]的方法，该物种的OCI(雌雄异位、花冠直径)(OCI=4)和性分配特征P/O(2 448.11±448.32)上均进化出兼性异交特征外，还在花粉呈现式样、花回馈及访花频率上表现出适应于异花授粉的特征。在授粉实验中，自花授粉花表现出很低的结籽率(自发自交为0，人工自花为5.93%)，属于自交不亲和类型；此外，自然传粉花的结籽率比人工异花授粉花低，说明存在较高的花粉限制现象(40.71%)。自交不亲和传粉者访花频率及效率是影响雌性繁殖成功的主要因素[2,42-44]，在自然居群中该物种主要传粉者的高移出低沉积的传粉者效率、访花频率及交配系统特点是导致花粉限制的主要原因；该物种传粉者依赖的花粉限制方面需要进一步研究。

总之，该物种长期适应新疆南部塔克拉玛干沙漠边缘荒漠环境过程中，通过花内雌雄器官空间位置的分离和花粉逐步呈现(不完全)的策略来避免雌雄功能之间的干扰，削弱雄蕊内部之间干扰和花粉间的竞争，来保障雄性繁殖；但在雌性阶段花回馈依赖的访花频率及传粉者效率变化以及自交不亲和性是降低雌性繁殖并导致花粉限制的主要因素。