高寒草甸链霉菌Qhu-M197活性次级代谢产物的研究

樊嘉凯 向信 邓佳文 邱庆辉 马艳 张得钧 张本印

(青海大学生态环境工程学院，西宁 810016)

天然产物对于新药研发至关重要，过去40年来，小分子药物50%以上直接或间接来源于天然产物[1]。微生物天然产物是天然产物重要的组成部分，其在抗感染和抗肿瘤方面的活性尤为突出[2-3]。放线菌次级代谢产物占微生物天然产物的比例很高，目前临床近70%的抗生素都由放线菌产生[4]，但从传统生境来源放线菌中发现新化合物的几率不断下降，而已知化合物重复发现率极高[5]。栖息于特殊生态环境(简称特境)的微生物为适应逆境因子，演化出了独特的适应能力和功能基因，包括活性天然产物的生物合成基因。目前，在极地[6]、深海[7]、盐湖[8]、火山口[9]和热泉[10]等极端生境中都分离到了新颖的微生物物种和次级代谢产物。近些年，随着抗生素滥用及多重耐药菌的出现，寻找新型抗生素已迫在眉睫，因此越来越多的研究者将目光投向了对特境微生物，尤其是放线菌，希望通过发掘特境放线菌次级代谢产物研发出克服耐药菌的新型抗生素。

青藏高原号称“世界屋脊”，具有低温、干旱、营养贫瘠、强紫外、低氧和低压等多种逆境因子[11]，相比于传统生境，生长在此的微生物为适应特境，应具有特殊的生理功能、生存能力及代谢途径。目前，青藏高原放线菌研究多数局限于抗菌等方面的活性筛选，如张玲等[12]从青藏高原土壤中分离到了151株链霉菌，其中68株具有抗菌活性。马爱爱等[13]从青藏高原冻土中分离到54株放线菌，对其进行了形态学和分子分类鉴定，并开展了抗菌活性研究，但放线菌的次级代谢产物研究较少。

本实验室前期筛选到一株青藏高原高寒草甸土壤来源放线菌Qhu-M197，由于该菌株具有较强抗菌、抗肿瘤活性，因此，本研究对该菌株开展了初步鉴定，同时，在优化发酵培养基的基础上，开展了活性次级代谢产物的分离、鉴定，另外还评价了主要活性成分的抗菌和抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

菌株Qhu-M197分离自青海省黄南藏族自治州泽库县海拔3959 m的高山草甸(E101°29'17.27''，N35°13'47.25'')土壤样品。

1.1.2 培养基

MS固体培养基：D-甘露醇20 g，大豆粉20 g，琼脂20 g，1 L自来水，pH 7.2。

YMG液体培养基：酵母提取物4 g，麦芽提取物10 g，葡萄糖4 g，1 L蒸馏水，pH 7.2。

ISP4液体培养基：可溶性淀粉10 g，磷酸氢二钾1 g，七水硫酸镁2 g，氯化钠1 g，硫酸铵2 g，碳酸钙2 g，微量盐1 mL。微量盐：七水硫酸亚铁0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，七水硫酸锌0.1 g，1 L蒸馏水，pH 7.2。

TSB液体培养基：胰酪胨大豆肉汤30 g，1 L蒸馏水，pH 7.2。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，1 L蒸馏水，pH 7.2。

1.1.3 主要试剂及仪器

化学纯甲醇、乙酸乙酯(天津富宇化工)、色谱纯甲醇(上海麦克林生化科技有限公司)、MCI GEL大孔吸附树脂(日本三菱化学公司)、Sephadex LH-20(北京索莱宝科技有限公司)、MEM培养基、胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司)、半制备高效液相色谱仪LC-20AT(日本岛津公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)、生物安全柜(太仓艺斯高医疗器械科技有限公司)、三气培养箱(上海力申科学仪器有限公司)、核酸提取仪FastPrep-24TM(美国MP Biomedicals公司)。

1.1.4 指示菌及肿瘤细胞株

指示菌：大肠埃希菌(Escherichia coliATCC25922)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilisATCC 51650)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC51650)、白念珠菌(Candida albicansATCC 10231)；肿瘤细胞株：人HepG2肝癌细胞和人MCF-7乳腺癌细胞；保存于青海大学生态环境工程学院生物制药基础实验室。

1.2 方法

1.2.1 菌株Qhu-M197的分子鉴定

将菌株Qhu-M197在TSB培养基中培养72 h，获得的培养液在8000 r/min离心3 min，收集菌体，无菌水清洗2次，使用核酸提取仪破碎细胞提取基因组DNA，作为PCR模板。使用细菌通用性扩增引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rRNA基因扩增。PCR反应体系为25 μL：ddH2O 9.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，PremixTaq12.5 μL。PCR反应程序为：95℃预变性6 min；95℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经纯化后送兰州天启基因生物科技有限公司进行测序。对测序结果进行拼接校对后，将拼接后的序列导入EzBioCloud数据库进行比对，下载相似性较高的代表性菌株序列，使用MEGA7.0软件，以Maximum Composite Likelihood模型计算遗传距离，采用邻接法(Neighbor-joining，N-J)构建系统发育树。Bootstrap自展1000次检验进化树拓扑结构置信区间。

1.2.2 菌株Qhu-M197小量发酵及抗菌活性筛选

菌株Qhu-M197接种于5 mL TSB液体培养基中，28℃，200 r/min摇床培养3 d，制备种子液；然后将种子液以5%体积转接于50 mL液体发酵培养基(YMG和ISP4)中，28℃，200 r/min旋转摇床培养7 d。同时吸取200 μL种子液涂布于MS固体培养基，28℃恒温箱培养10 d。发酵完成后，使用等体积乙酸乙酯分别对液体和固体培养基发酵产物进行萃取，乙酸乙酯相经旋转蒸发仪浓缩得到发酵提取物。

将发酵提取物用甲醇配制浓度为100 mg/mL，采用纸片扩散法[14]检测样品对4种指示菌的抗菌活性，以两性霉素B、氨苄西林钠和阿奇霉素为阳性对照，甲醇为阴性对照。

1.2.3 菌株Qhu-M197固体培养大量发酵与萃取

取保存于20%甘油中的菌株Qhu-M197，接种于5 mL TSB液体培养基中，28℃，200 r/min，旋转摇床培养3 d。将活化好的菌株，在MS固体培养基划线分离，28℃恒温箱培养3 d，挑取单菌落，转接到含50 mL TSB液体培养基的250 mL锥形瓶中，28℃，200 r/min旋转摇床培养3 d，制备种子液，吸取200 μL种子液涂布于MS平板上，28℃，恒温箱避光培养10 d，每个平板倒30 mL左右培养基，共计10 L培养基。待发酵完成后，将所有发酵平板切碎，使用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取物后，浓缩、干燥和称重，获得样品5.35 g。

1.2.4 菌株Qhu-M197次级代谢产物的分离纯化及结构鉴定

发酵提取物经MCI大孔吸附树脂分离、甲醇水溶液：20%、40%、60%、80%和100%的梯度洗脱，HPLC检测分析后，合并洗脱液，得到馏分：Fr.1～Fr.10。各个馏分抗菌活性追踪结果表明，Fr.7和Fr.8具有较好抗菌活性，随后对这两个馏分进一步纯化。Fr.7经Sephadex LH-20柱层析(氯仿:甲醇1:1，V/V)分离，结合HPLC检测合并得到5个馏分Fr.7.1～Fr.7.5。其中Fr.7.1与Fr.8.2合并后，再次使用Sephadex LH-20柱层析(氯仿:甲醇,1:1，V/V)进行分离，经HPLC检测合并得到3个子馏分Fr.7.1-1～Fr.7.1-3。采用半制备高效液相色谱进一步分离时的色谱柱均为Shim-pack GIST C18柱(10 mm×250 mm，5 μm)，流速4 mL/min，检测波长254 nm。Fr.7.1-2采用半制备高效液相色谱(A相为水，B相为乙腈，38%B相等度洗脱)纯化，得到化合物S1(37.1 mg)。 Fr.7.3经半制备型高效液相色谱(A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇，50% B相等度洗脱)纯化后得到化合物S2(3.6 mg)和S3(3 mg)。Fr.8经Sephadex LH-20柱层析(氯仿:甲醇1:1，V/V)分离，HPLC检测合并得到6个馏分Fr.8.1～Fr.8.6。Fr.8.5经半制备型高效液相色谱(A相0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇，60% B相等度洗脱)纯化得到化合物S4(4 mg)。通过高分辨质谱(HR-ESIMS)结合核磁共振波谱(NMR)数据和文献数据的比对，鉴定出化合物S1～S4的化学结构。

1.2.5 化合物S1～S4抗菌活性评价

采用微量二倍稀释法[15]测定4个化合物的最小抑菌浓度MIC。DMSO溶解化合物，配制为浓度4 mg/mL的母液备用。在96孔板第一列每孔加入200 μL LB液体培养基，第2列加入100 μL LB液体培养基，第3列加入190 μL LB液体培养基，第4列及以后每列加入100 μL LB液体培养基，在第3列每孔加入样品10 μL，吹打混匀，再从第3列吸取100 μL至第4列，吹打混匀后，按上述操作依次2倍稀释至第12列，第12列吸取100 μL弃去。

4种指示菌37℃，180 r/min培养12 h后，使用灭菌后的LB培养基稀释1000倍，除第一列外，每孔加入100 μL稀释菌液，使各化合物终浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39和0.19 μg/mL。实验设3个重复，以两性霉素B、氨苄西林钠、阿奇霉素为阳性对照，甲醇为阴性对照。将96孔板置于37℃恒温箱培养16 h，观察检定菌培养基浑浊度，培养基最澄清的最低药物浓度即为该化合物的MIC。

1.2.6 化合物S1～S4细胞毒活性评价

分别取对数生长期的HepG2细胞，MCF-7细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，使用添加10%胎牛血清的MEM培养基将细胞稀释为1×105个/mL的细胞悬浮液，以每孔100 μL接种于96孔板中，37℃，5%CO2的细胞培养箱内培养24 h。化合物用DMSO溶解作为母液，并用MEM培养基将母液稀释至0.01、0.1、1、10和100 μg/mL等5个浓度后备用。待细胞贴壁，吸弃96孔板中原有培养基，将已配制好的含有化合物的MEM培养基加入到96孔板中，每孔100 μL，每个浓度做6个重复孔。依据首次筛选结果，将化合物S1的处理浓度改为0.25、0.5、1、2和4 μg/mL。化合物S2、S3和S4的处理浓度改为12.5、25、50、100和200 μg/mL。使用CCK-8[16]法测定细胞活性，酶标仪测定450 nm处的吸光度，根据以下公式计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组细胞吸光值/对照组细胞吸光值)100%。Graphad prism8.0软件计算化合物的IC50值。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

通过对菌株Qhu-M197的16S rRNA基因测序(GenBank收录号为ON6520616)，将序列上传至EzBioCloud数据库进行比对，选取同源性较高的序列构建系统发育树(图1)，结果显示，菌株Qhu-M197与Streptomyces phaeoluteigriseusDSM 41896T(MPOH01000466)在同一分类支上，相似度为100.00%，初步鉴定该菌株为Streptomyces phaeoluteigriseussp.Qhu-M197。

2.2 链霉菌Qhu-M197发酵产物抑菌活性评价

利用YMG、ISP4培养基对Qhu-M197进行液体发酵，MS培养基对其进行固体发酵，采用纸片扩散法检测菌株Qhu-M197的3种培养基发酵产物对大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、白念珠菌的抗菌活性。结果显示，菌株Qhu-M197发酵产物对金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌具有显著的抑制活性，并且MS固体培养基发酵产物的抗菌活性最强(图2和表1)。基于以上活性评价，后续研究选用MS固体培养基对菌株Qhu-M197进行大量发酵并进一步对其发酵产物中的活性成分进行分离和结构鉴定工作。

表1 菌株 Qhu-M197 3种发酵产物的抑菌活性结果Tab.1 The results of antimicrobial activity of fermentation products with three media of the strain Qhu-M197

2.3 菌株Qhu-M197次级代谢产物的分离及结构鉴定

菌株Qhu-M197以MS为培养基，进行固体培养，经乙酸乙酯萃取和浓缩干燥，共获5.35 g粗提物，经过MCI大孔吸附树脂、Sephadex LH20凝胶层析和半制备HPLC分离，获得代号为S1～S4的4个化合物，经1H NMR、13C NMR、HR-ESI-MS高分辨质谱分析及与文献数据比对，确定其分别为mithramycin (S1)，aerugine (S2)、aeruginol (S3)和2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dihydroxy-6H-1,5-benzoxazocin-6-one(S4)，化学结构如图3所示。

化合物S1：黄色粉末状(甲醇)，HR-ESI-MS:m/z[M-H]-1083.4658(cal 1083.4654)，分子式为C52H76O24。1H NMR (500 MHz,CD3OD): δ 2.74(1H,overlapped,3-H),2.73(1H,overlapped,4-Ha),2.44(1H,overlapped,4-Hb),6.32 (1H,s,5-H),2.04(3H,s,7-CH3),6.53 (1H,s,10-H),4.85(1H,s,1’-H),3.45(3H,s,1’-OCH3),4.26(1H,overlapped,3’-H),4.26(1H,overlapped,4’-H),1.30(3H,s,5’-CH3),4.61(1H,d,J=10.0 Hz,1A-H),2.20(1H,dd,J=5.0,12.0 Hz,2AH),1.57(1H,m,2A-H),3.62(1H,d,J=8.5 Hz,3AH),2.99(1H,d,J=8.5 Hz,4A-H),3.41(1H,m,5A-H),1.38(1H,d,J=6.0 Hz,6A-H)，4.76(1H,overlapped,1B-H),2.08(1H,m,2B-H),1.74(1H,d,J=10.5 Hz,2B-H),4.28(1H,overlapped,3B-H),3.06(1H,t,J=10.5 Hz,4BH),3.31(1H,overlapped,5B-H),1.28(1H,overlapped,6B-H)，5.04(1H,d,J=10.0 Hz,1C-H),2.67(1H,d,J=10.0 Hz,2C-H),1.59(1H,m,2C-H),3.79(1H,m,3C-H),3.06(1H,overlapped,4C-H),3.38(1H,m,5CH),1.31(1H,overlapped,6C-H),1.96(1H,m,2D-H),1.80(1H,overlapped,2D-H),3.88(1H,d,J=6.7 Hz,3D-H),3.70(1H,overlapped,4D-H),2.96(1H,q,J=9.0 Hz,5D-H),1.30(1H,overlapped,6D-H),4.99(1H,dd,J=2.0,10.0 Hz，1E-H),1.95(1H,m,2EH),1.62(1H,m,2E-H),1.25(1H,overlapped,H-CH3).2.94(1H,overlapped,4E-H),3.71(1H,overlapped,5EH),29(1H,overlapped,6E-H).13C NMR (126 MHz,CD3OD): δ 202.9(C-1),76.9(C-2),41.5(C-3),26.7(C-4),135.5(C-4a),100.6(C-5),158.4(C-6),110.2(C-7),7.3(7-CH3),155.2(C-8),107.0(C-8a),163.3(C-9),107.8(C-9a),116.7(C-10),138.0(C-10a),81.7(C-1’),58.1(1’-OCH3),212.2(C-2’),77.0(C-3’),68.3(C-4’),18.5(C-5’),98.9(C-1A),39.4(C-2A),70.6(C-3A),76.7(C-4A),72.1(C-5A),17.4(C-6A),95.7(C-1B),36.5(C-2B),78.7(C-3B),75.2(C-4B),71.6(C-5B),15.7(C-6B),100.7(C-1C),35.9(C-2C),79.5(C-3C),74.9(C-4C),80.1(C-5C),16.8(C-6C),98.6(C-1D),31.8(C-2D),75.9(C-3D),69.1(C-4D),76.5(C-5D),17.3(C-6D),97.5(C-1E),43.6(C-2E),70.5(C-3E),26.0(3E-CH3),76.4(C-4E),70.4(C-5E),16.8(C-6E)。以上化合物的波谱数据与文献[17-18]报道基本一致，确定化合物S1为mithramycin。

化合物S 2：灰褐色固体(甲醇)，H R-E S IMS:m/z[M+H]+209.0582(cal 209.0510)，分子式为C10H11NO2S。1H NMR (500 MHz,CD3OD) δ4.81(1H,m,4-H),3.48(1H,dd,J=11.0,8.8 Hz,5-H),3.79 (2H,dd,J=5.5,1.1 Hz,6-H),6.95～6.86 (2H,m,3',5'-H),7.42(1H,dd,J=7.9,1.6 Hz,4'-H),7.35 (1H,ddd,J=8.7,7.3,1.7 Hz,6'-H).13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ173.61(C-2),79.54(C-4),33.73(C-5),64.26(C-6),117.60(C-1’),160.23(C-2’),117.85(C-3’),134.11(C-4’),119.99(C-5’),131.64(C-6’)。以上化合物的波谱数据与文献[19]报道基本一致，确定化合物S2为aerugine。

化合物S3：灰褐色固体，HR-ESI-MS:m/z[M+H]+207.0425(cal 207.0354)，分子式为C10H9NO2S。1H NMR (500 MHz,CD3OD): δ 7.38 (1H,t,J=1.0 Hz,5-H),4.74 (2H,d,J=1.0 Hz,6-H),4.74(2H,d,J=1.0 Hz,6-H),7.75 (1H,dd,J=7.9,1.6 Hz,3’-H),6.92 (1H,td,J=7.5,1.2 Hz,4’-H),7.31 (1H,ddd,J=8.5,7.2,1.6 Hz,5’-H),6.98 (1H,dd,J=8.3,1.1 Hz,6’-H).13C NMR (126 MHz,CD3OD): δ168.54(C-2),156.23(C-4),113.29(C-5),59.48(C-6)，117.12(C-1’),155.90(C-2’),126.93(C-3’),119.23(C-4’),131.29(C-5’),116.89(C-6’)。以上化合物的波谱数据与文献[20]报道基本一致，确定化合物S3为aeruginol。

化合物S 4：灰褐色固体(甲醇)，H R-E S IMS:m/z[M+H]+209.0581(cal 209.0688)，分子式为C10H11NO4。1H NMR (500 MHz,CD3OD): δ3.48 (1H,dd,J=11.0,8.8 Hz,3-H),3.37 - 3.30 (2H,m,3-H),4.86- 4.78 (1H,m,4-H),3.79 (2H,dd,J=5.5,1.2 Hz,5-H),6.96 - 6.84 (2H,m,8,10-H),7.35 (1H,ddd,J=8.7,7.3,1.7 Hz,9-H),7.42 (1H,dd,J=7.8,1.6 Hz,11-H).13C NMR (126 MHz,CD3OD):δ 172.16(C-1),32.28(C-3),78.08(C-4),62.81(C-5),158.77(C-7),116.40(C-8),132.65(C-9),118.54(C-10),130.19(C-11),116.15(C-12)。以上化合物的波谱数据与文献[21]报道基本一致，确定化合物S4为2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dihydroxy-6H-1,5-benzoxazocin-6-one。

2.4 化合物S1～S4的抗菌活性和细胞毒活性

采用微量二倍稀释法测定了化合物S1～S4的最小抑菌浓度，结果如表2所示，化合物S1对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌均具有较强的抑制活性，MIC值分别为0.012和0.095 μg/mL，但对革兰大肠埃希菌和白念珠菌未表现出显著抑制活性。化合物S2、S3及S4对4种指示菌均无明显抑制活性。

表2 化合物S1～S4的抑菌活性(MIC,μg/mL)Tab.2 The antimicrobial activity of compounds S1～S4(MIC,μg/mL)

CCK-8法检查化合物S1～S4对两株肿瘤细胞HepG2、MCF-7的生长抑制活性。结果表明， 化合物S1的IC50分别为0.45和0.46 μmol/L。化合物S2、S3和S4仅在浓度大于100 μg/mL及以上时，对HepG2和MCF-7肿瘤细胞具有一定程度的增殖抑制作用。

3 讨论与结论

极端生境是新型抗生素的重要来源[22]。Bao等[23]从1株西藏荒漠土壤来源的链霉菌Streptomycessp.XZHG99T的次级代谢产物中分离到了3种新的angucycline类化合物，这3个化合物对5株肿瘤细胞显示出显著的细胞毒活性，IC50最低0.09 nmol/L。

本研究对青藏高原高山草甸土壤样品中分离出的菌株Qhu-M197开展了次级代谢产物研究。通过3种发酵培养基小量发酵，结合抗菌活性筛选，最终选定MS固体培养基作为发酵培养基，并从其发酵产物中分离鉴定了4个化合物，即mithramycin(S1)，aerugine (S2)、aeruginol (S3)、以及2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dihydroxy-6H-1,5-benzoxazocin-6-one(S4)。发现化合物S1即mithramycin，对金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌具有显著的抗菌活性；同时对两株肿瘤细胞HepG2和MCF-7显示出显著细胞毒活性。文献报道mithramycin是一种抗革兰阳性菌、抗肿瘤的抗生素，但对革兰阴性菌无活性[24]，这与我们研究结果一致。另据文献报道，aerugine (S2)对一些植物病原真菌表现出了一定程度的抑制作用[19]。以上研究表明，青藏高原高寒草甸来源的链霉菌是抗菌和抗肿瘤活性次级代谢产物的重要来源。本研究丰富了青藏高原特境来源放线菌活性次级代谢产物的研究结果，为拓展该特境放线菌的应用奠定了基础。