军事航空噪声性隐匿性听力损失动物模型的建立与评价

刘玉辉姜一弘张卓儒陈学敏张敏吴侃张久旺刁殿龙王小成*

1空军军医大学航空航天医学系航空航天临床医学中心，教育部航空航天医学重点实验室（西安 710032）

2空军军医大学第一附属医院空勤科（西安 710032）

3解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部（北京 100853）

4空军军医大学基础医学院（西安 710032）

直升机的主要噪声源产生于发动机，其次是传动装置、旋翼、尾桨和尾桨齿轮箱等，武装直升机的武器装备系统也是另一重要的噪声源。直升机舱内噪声强度可达84-110dB SPL，频带较宽，频率特性以低频为主，能量主要来自500Hz以下的低频区，属于高强低频噪声[1]。在前期的研究中，我们也探索了军用直升机噪声对听力的损伤程度、特点、机制及防护[2,3]。

隐匿性听力损失（Hidden Hearing Loss,HHL）是指患者主诉聆听困难，尤其在噪音环境中对语言的辨听能力下降，但其纯音听阈基本处于正常范围之内，主观检查上并不存在听力障碍的情况。研究证实，这类听觉功能障碍的主要损伤部位是内耳内毛细胞与螺旋神经纤维之间的内毛细胞带状突触，该突触是听觉通路中第一个兴奋性传入突触，对于声音的传递和编码具有决定性作用[4-6]。军用直升机空勤和地勤人员不可避免地暴露于高强低频噪声环境中，听觉系统面临更高的损伤风险。

本研究将豚鼠暴露于某军用直升机噪声环境中，观察噪声暴露后不同时间点豚鼠听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）及畸变耳声发射（distortion product otoacoustic emission,DPOAE）的变化，为建立军事航空噪声性HHL模型以及为进一步机制研究奠定基础。

1 方法

1.1 实验动物

雄性豚鼠90只，由空军军医大学实验动物中心提供，体重约300～350g，无噪声暴露史，ABR测试听阈正常。所有豚鼠进行常规喂养，提供充足饮食，适当补充维生素C，12h/12h明暗循环光照，实验前适应性喂养1周。实验操作经空军军医大学动物伦理委员会批准。

豚鼠随机分为3组，每组30只，分别为100dB(A)组、105 dB(A)组、110dB(A)组,不同噪声强度组再随机平均分为5组，1个对照组和4个实验组，实验组接受相同强度、相同时间噪声刺激，按噪声暴露后时间分组，分别为暴露后1天组（1d PE），暴露后1周组（1w PE），暴露后2周组（2w PE），暴露后1个月组（1m PE）。

1.2 试剂和仪器

戊巴比妥钠（美国Sigma公司）；速眠新Ⅱ注射液（吉林省华牧动物保健品有限公司）；音箱（广州声霸SF-12+全频，中国）；功效（广州声霸QA-700+全频，中国）；声级计（宏诚HT-8352，中国）；脑干诱发电位（Otometrics ICS chapter EP,丹麦）；耳声发射测试仪（MADSEN Capella，丹麦）。

1.3 噪声刺激

本实验所用噪声为我国航空兵部队某型军用直升机运行过程中采集的环境噪声，包含发动机噪声、旋翼噪声等，经功效输入至扬声器循环播放。将豚鼠置于鼠笼（尺寸约为11cm×11cm×25cm大小）中，扬声器置于鼠笼两侧，以声级计A计权测试噪声强度，豚鼠活动范围内声压级相差＜3dB(A)。

各实验组豚鼠接受相应强度的军用直升机噪声刺激2h，对照组不给予军用直升机噪声刺激，笼内本底噪声＜20dB(A)，其他条件与实验组相同。

1.4 豚鼠听性脑干反应（ABR）测试

各实验组豚鼠在噪声暴露后相应的时间节点进行ABR测试，采用1%戊巴比妥钠（0.3mL/100g）联合0.05ml速眠新Ⅱ腹腔注射对其进行麻醉。麻醉满意后，将记录电极置于豚鼠两耳连线中点皮下，参考电极置于测试耳耳后皮下，接地电极插入后肢根部。

实验采用短声（Click）和短纯音（Tone burst）作为刺激声，刺激强度从80dB(A)开始，以能分辨出ABRⅢ波的最低刺激声强度为豚鼠听阈值，同时记录短声（Click）刺激不同强度下的Ⅰ波波幅及80dB处Ⅰ波潜伏期。

1.5 豚鼠畸变产物耳声发射（DPOAE）测试

麻醉满意后，将大小合适的探头妥当放置于一侧耳的外耳道，两个不同纯音的频比关系设置为f2/f1=1.22，f1强度为65dB SPL，f2强度为55dB SPL，选取8个测试点(见表1)，测量2f1-f2处的畸变产物耳声发射，记录DPOAE幅值和信噪比(signal noise ratio，SNR)。以DPOAE幅值高于本底噪声3dB(A)，即SNR＞3dB(A)作为检出的标准。

表1 畸变产物耳声发射8个测试点的频率(Hz)Table 1 Frequency of 8 test points of DPOAE(Hz)

1.6 统计分析

采用SPSS 23.0对资料进行分析，GraphPad Prism 7.0进行图表绘制。数据均以X±SEM表示。噪声刺激前后各组ABR阈值、ABRⅠ波波幅和DPOAE幅值比较用单因素方差分析，各组组间比较采用Dunnett检验或LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABR测试结果

2.1.1 ABR阈值

100 dB SPL噪声暴露后1天，测得Click、1kHz、2 kHz、4 kHz、8 kHz处听阈值（见图1）较暴露前明显升高，约10-30dB SPL（P＜0.05,n=12）。暴露后1周,各处听阈值呈现出恢复趋势，1kHz、2 kHz、8 kHz处阈值与暴露前比已无统计学差异（P＞0.05,n=12）。暴露后2周，各频率听阈值均已恢复至暴露前水平（P＞0.05,n=12），表明100dB SPL军用直升机噪声暴露2小时导致豚鼠出现暂时性阈移。

图1 100dB SPL军用直升机噪声刺激后各组豚鼠ABR阈值变化(dB SPL,n=12)Fig.1 The alterations of ABR threshold of guinea pigs in each group after 100dB SPL military helicopter noise exposure(dB SPL,n=12)

105dB SPL噪声刺激2小时后，听阈水平变化趋势与100 dB(A)组相似（见图2），即暴露后1天，各频率听阈值较暴露前明显升高30-40dB SPL（P＜0.01,n=12）。暴露后2周，观察到各频率听阈水平均已恢复至暴露前水平（P＞0.05,n=12），表明105dB SPL军用直升机噪声暴露2小时也只导致豚鼠出现暂时性阈移。

图2 105dB SPL军用直升机噪声刺激后各组豚鼠ABR阈值变化(dB SPL,n=12)Fig.2 The alterations of ABR threshold of guinea pigs in each group after 105dB SPL military helicopter noise exposure(dB SPL,n=12)

110 dB SPL噪声暴露后1天，各频率听阈值（见图3）较暴露前明显升高30-50dB SPL（P＜0.01,n=12）。暴露后1月，Click、1kHz、2 kHz处阈值与暴露前相比，已无统计学差异（P＞0.05,n=12）；但4 kHz、8 kHz处阈值仍高于暴露前水平（P＜0.01,n=12），表明110dB SPL军用直升机噪声暴露2小时导致豚鼠出现永久性阈移。

图3 110dB SPL军用直升机噪声刺激后各组豚鼠ABR阈值变化(dB SPL,n=12)Fig.3 The alterations of ABR threshold of guinea pigs in each group after 110dB SPL military helicopter noise exposure(dB SPL,n=12)

2.1.2 Ⅰ波波幅

100dB SPL噪声暴露后，Click 20dB-80dB处Ⅰ波波幅变化见图4。暴露后1天，测得除70dB外，各处Ⅰ波波幅较暴露前明显降低（P＜0.05,n=12）。在暴露后1周各处Ⅰ波波幅已恢复至暴露前水平（P＞0.05,n=12），表明100dB SPL军用直升机噪声暴露2小时不会导致豚鼠ABRⅠ波波幅下降。

图4 100dB SPL军用直升机噪声刺激后各组豚鼠ABRⅠ波波幅变化(µV,n=12)Fig.4 The alterations of ABR wave I amplitude of guinea pigs in each group after 100dB SPL military helicopter noise exposure(µV,n=12)

105dB SPL噪声暴露后，Click 20dB-80dB处Ⅰ波波幅变化见图5。暴露后1天，测得各处Ⅰ波波幅较暴露前明显降低（P＜0.01,n=12）。暴露后1周Ⅰ波波幅呈现出恢复趋势，但暴露后1月,40dB、50dB、60dB、70dB、80dB处Ⅰ波波幅仍未恢复至暴露前水平（P＜0.05,n=12）。因此，105dB SPL军用直升机噪声暴露2小时可导致豚鼠ABRⅠ波波幅下降。

图5 105dB SPL军用直升机噪声刺激后各组豚鼠ABRⅠ波波幅变化(µV,n=12)Fig.5 The alterations of ABR wave I amplitude of guinea pigs in each group after 105dB SPL military helicopter noise exposure(µV,n=12)

110dB SPL噪声暴露后，Click 20dB-80dB处Ⅰ波波幅变化见图6。暴露后1天，测得各处Ⅰ波波幅较暴露前明显降低（P＜0.01,n=12）。暴露后1周，Ⅰ波波幅呈现出恢复趋势，但暴露后1月,30dB、40dB、50dB、60dB、70dB、80dB处Ⅰ波波幅仍未恢复至暴露前水平（P＜0.05,n=12），表明110dB SPL军用直升机噪声暴露2小时可导致豚鼠ABRⅠ波波幅下降。

图6 110dB SPL军用直升机噪声刺激后各组豚鼠ABRⅠ波波幅变化(µV,n=12)Fig.6 The alterations of ABR wave I amplitude of guinea pigs in each group after 110dB SPL military helicopter noise exposure(µV,n=12)

2.1.3 Ⅰ波潜伏期

100dB SPL、105dB SPL、110dB SPL噪声暴露后，Click 80dB处Ⅰ波潜伏期变化见图7。不同噪声强度暴露后，Ⅰ波潜伏期均有波动，但无统计学差异(P＞0.05,n=12)。

图7 军用直升机噪声刺激后各组豚鼠ABRⅠ波潜伏期变化(ms,n=12)Fig.7 The alterations of ABR wave I latency of guinea pigs in each group after military helicopter noise exposure(ms,n=12)

2.2 DPOAE幅值

100dB SPL噪声暴露后，各组DPOAE幅值变化见表2。暴露后1天，不同频率均表现出下降趋势，其中 750Hz、1kHz、2kHz、3kHz、4kHz、6kHz、8kHz处DPOAE幅值较暴露前差异明显（P＜0.05,n=12）。暴露后2周，各处DPOAE幅值均恢复至暴露前水平（P＞0.05,n=12）。

表2 100dB SPL军用直升机噪声刺激后各组豚鼠DPOAE幅值(dB，n=12)Table 2 DPOAE amplitudes of guinea pigs in each group after 100dB SPL military helicopter noise exposure(dB，n=12)

105dB SPL噪声暴露后，各组DPOAE幅值变化见表3。暴露后1天，不同频率均表现出下降趋势，其 中 750Hz、2kHz、3kHz、4kHz、6kHz、8kHz 处DPOAE幅值较暴露前差异明显（P＜0.05,n=12）。暴露后1月，4kHz处DPOAE幅值与暴露前比，仍然差异明显（P＜0.05,n=12）。

表3 105dB SPL军用直升机噪声刺激后各组豚鼠DPOAE幅值(dB，n=12)Table 3 DPOAE amplitudes of guinea pigs in each group after 105dB SPL military helicopter noise exposure(dB，n=12)

110dB SPL噪声暴露后，各组DPOAE幅值变化见表4。暴露后1天，不同频率均表现出下降趋势，其中750Hz、1kHz、2kHz、3kHz、4kHz、6kHz、8kHz处DPOAE幅值较暴露前差异明显（P＜0.05,n=12）。暴露后1月，4kHz、6kHz、8kHz处DPOAE幅值仍低于暴露前水平（P＜0.05,n=12）。

表4 110dB SPL军用直升机噪声刺激后各组豚鼠DPOAE幅值(dB，n=12)Table 4 DPOAE amplitudes of guinea pigs in each group after 110dB SPL military helicopter noise exposure(dB，n=12)

3 讨论

军人在军事作业过程中时常会暴露于武器装备产生的高强度噪声，与非噪声环境作业人员相比，耳鸣、耳痛、听觉分辨率下降以及暂时性听阈升高的发生率明显升高[7]，可能与HHL密切相关，严重影响其作业能力、生活质量和身体健康。

文献报导，以豚鼠为实验对象，建立噪声性HHL动物模型的噪声暴露条件为宽频带噪声105 dB SPL暴露2小时[8]。因此，为建立军事航空噪声性HHL动物模型，我们选取的噪声暴露声压级为100 dB SPL、105 dB SPL、110 dB SPL，暴露时间为2小时进行探索，并先通过功能学进行评价。

ABR的Ⅰ波起源于耳蜗螺旋神经节细胞，研究[9,10]表明阈上刺激ABRⅠ波波幅与耳蜗带状突触数量和功能密切相关。ABR的Ⅲ波起源于耳蜗核以及内侧上橄榄核，豚鼠的Ⅲ波波幅最大最稳定，既往文献采用Ⅲ波作为主波评价豚鼠的听力水平[2,3]。本实验动态观察click以及短纯音1k、2k、4k、8kHz不同频率，在噪声暴露后不同时间点的听阈变化；动态记录clickⅠ波波幅。结果表明，100dB SPL军用直升机噪声暴露后听阈表现为暂时性域移，Ⅰ波波幅未降低；105dB SPL军用直升机噪声暴露后听阈表现为暂时性域移，Ⅰ波波幅降低；110dB SPL军用直升机噪声暴露后听阈表现为永久性域移，Ⅰ波波幅降低。从功能学角度来讲，ABR阈值正常、阈上刺激ABRⅠ波幅值降低是既往文献[11]采用的HHL动物模型的判断方法之一。因此，我们认为105dB SPL军用直升机噪声暴露2小时可作为建立HHL动物模型的刺激参数。

DPOAE与外毛细胞的功能状态密切相关,其幅值与主观听阈检查呈频率对应关系，2f1-f2处DPOAE幅值最高，是反映主观听阈f2或√f1f2处频率的听敏度[12]。本实验结果表明，各组DPOAE幅值在刺激后表现为明显的恢复时间依赖性和损伤剂量依赖性。不同噪声强度，DPOAE幅值在暴露后1天降低，随着时间推移，均有一定程度恢复，但随着噪声强度的增大，受影响的频率位点也会变多，主要集中在4-8kHz的高频区。DPOAE不仅取决于外毛细胞的存活而且与外毛细胞的功能状态密切相关，韩曙光等[13]在用C57BL/6J小鼠建立HHL动物模型的实验中，扫描电镜的结果提示噪声暴露后2周外毛细胞的纤毛存在倒伏的情况。此外，文献[12]报道DPOAE较纯音测听可更敏感地反映外毛细胞的细小变化。因此，我们推测，105 dB组、110dB组高频区的DPOAE幅值在暴露后一月仍低于暴露前水平，可能的原因是外毛细胞纤毛受损。结合本课题组前期的研究[2]，DPOAE可作为辅助手段检测听力评价豚鼠听力损失情况，但HHL动物模型的建立，在听觉电生理方面应以ABR的变化为主要评价标准。

本研究通过ABR和DPOAE对不同强度噪声暴露后不同时间点的听觉功能进行了动态评价，但系统、准确评价听力损失情况，还要进一步通过耳蜗基底膜铺片，带状突触计数，扫描电镜和透射电镜等技术和方法进行形态学方面的评价和分析。

4 结论

本实验证实，豚鼠暴露于105dB SPL军用直升机噪声2小时，听力表现为暂时性听阈偏移，阈上刺激ABRⅠ波波幅降低。从功能学角度，确定了军事航空噪声性HHL模型的理想刺激参数，为进一步开展军事航空噪声性HHL相关研究提供了较好的动物模型。此外，ABR是HHL发生时主要的功能学评价指标，而DPOAE是反映听觉系统状态的敏感指标，可作为辅助手段。