无花果活性内生细菌的分离鉴定及生长条件优化

李中源 曾忠秀 李梦霜 姜梦柯 杨林美 杜 欣 李淑英

（玉溪师范学院化学生物与环境学院，云南玉溪 653100）

无花果（Ficus carica Linn.）又名奶浆果、映日果、蜜果等，为桑科榕属落叶灌木或小乔木，现全国各地均有栽培，新疆南部尤多[1]。无花果具有极高的经济价值和食用价值，可作食用，亦可作药用[2-3]。植物内生菌因具有作为新型抗菌药物筛选源的巨大潜力而备受关注，关于内生菌的研究也成为近年来的热点。内生细菌在与宿主长期协同进化的过程中，逐渐形成了对抗、互惠等多种关系，能够直接或间接调节宿主的生长发育、协助宿主抵抗病虫害及环境胁迫等。内生细菌在与宿主互作的过程中能够产生丰富多样的次级代谢产物，逐渐成为新型天然产物开发研究的资源库。近年来，内生细菌及其次级代谢产物广泛应用于新药研发、生物防治等领域，展现出巨大的研究与开发价值[4-5]。

本试验从无花果汁中分离出内生细菌19株，用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌（Proteus vulgaris）采用平板对峙法筛选到4株活性内生细菌，活性检测后选择活性最强的2株观察其形态，研究生长条件及Cr6+对其生长的影响，以期为无花果活性内生细菌的深入开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为无花果（Ficus carica Linn.），于超市购买。

供试菌种为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），于湖北省工业微生物菌种保藏与研究中心购买；大肠杆菌（Escherichia coli）和变形杆菌（Proteus vulgaris），为我校微生物实验室保存。

供试培养基为LB培养基和发酵培养基。LB培养基配方为胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL；发酵培养基配方为黄豆粉10g，甘露醇10g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.5。2种培养基均于121℃条件下灭菌30 min备用。

1.2 试验方法

1.2.1 无花果内生细菌的分离及纯化。取新鲜无花果用无菌水冲洗后用75%乙醇浸泡2 min，然后用无菌水冲洗3次，再用3%NaClO浸泡3 min，之后用无菌水冲洗3次。冲洗消毒后的无花果用无菌刀切为小块后转入研钵，加100 mL无菌水与灭菌石英砂充分研磨。取0.5 mL菌液加入有4.5 mL无菌水的试管中，稀释10倍，吹打均匀。同样方法制成稀释1 000倍的菌悬液，静置15 min。取这两种菌悬液的上清液各0.5 mL涂布LB平板，每个浓度涂3个LB平板，35℃恒温培养24～48 h，挑选生长良好的单菌落纯化2～3次保存于4℃冰箱备用。同时，将最后一遍冲洗无花果的无菌水涂布于LB培养基上作对照，35℃培养24～48 h。

1.2.2 无花果活性内生细菌的筛选。用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌和分离纯化得到的内生细菌于LB固体培养基平板上划线（平板对峙法），于35℃下培养24～48 h后观察抑菌线，筛选出活性内生细菌。

1.2.3 活性内生细菌细胞DAN提取、PCR扩增及测序。采用改良的CTAB法[6-7]提取DNA，经电泳检测后进行PCR扩增。

（1）PCR 扩增。 采用 30 μL 体系：提取所得 DNA 1 μL、前引物和后引物各 1 μL（细菌通用引物：前引物 27F5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和后引物1525R5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、Taq 酶5.5 μL（Ex Taq 0.1 μL、10×Ex Taq Buffer 3 μL、dNTP mixture 2.4 μL）。

扩增程序：94℃预变性 4 min，94℃变性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，33个循环，最后72℃延伸10 min。

（2）碱基序列测序。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海捷瑞生物工程有限公司进行碱基测序，将测序得到的16S rDNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，与数据库中的已知序列进行同源性比较。

1.2.4 活性内生细菌革兰氏染色及芽孢染色。革兰氏染色及芽孢染色参照文献[8]进行。活性内生细菌培养至24 h进行革兰氏染色；培养至16 h开始进行芽孢染色[9]，时间间隔为2 h，培养至24 h后每隔0.5 h进行一次芽孢染色，最初出现芽孢的时间即为产芽孢时间。

1.2.5 无花果活性内生细菌活性检测。采用牛津杯琼脂扩散法来检测内生菌抑菌效果，取活化的3株检测指示菌分别制成菌悬液（5 mL无菌水洗脱3次），分别取0.5 mL倾注法接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，倒置培养24 h；筛选出的内生细菌分别接种到发酵培养基中，37℃恒温120 r/min摇床培养48 h，取发酵培养液置于无菌离心管中，在转速4 000 r/min下离心30 min，得到无细胞上清液；将接种了检测指示菌的平板等分为3份，用口径与牛津杯接近的打孔器在培养基上打孔后放入无菌牛津杯中，加无细胞上清液20 μL于牛津杯中，37℃培养48 h后测量其抑菌圈大小。

1.2.6 无花果活性内生细菌生长条件优化。将2株有活性的无花果内生细菌斜面转接2～3次，35℃下培养24 h备用；用5 mL无菌水洗脱斜面，重复3次，转入无菌试管中备用。活化菌种及制备菌悬液后测定培养时间、初始pH值、温度和重金属离子（Cr6+）对活性内生细菌生长的影响。

（1）培养时间对2株活性内生细菌生长的影响。取LB液体培养基100 mL，加入1 mL菌悬液，每株活性内生细菌设3个平行，置于35℃、转速120 r/min下恒温振荡培养，选用光电比浊法[8]制作细菌生长曲线。培养过程（96 h）中每隔12 h取样1次，于可见分光光度计600 nm下测其吸光度，绘制2株活性内生细菌的生长曲线。

（2）初始pH值对2株活性内生细菌生长的影响。将LB液体培养基pH值分别调节为5、6、7、8，每种pH值分别接入不同菌株活性内生细菌，100 mL培养基接入1 mL菌悬液，不同菌株各pH值均设3个平行，置于35℃、转速120 r/min下恒温振荡培养48 h，于可见分光光度计600 nm下测其吸光度。

（3）温度对2株活性内生细菌生长的影响。取LB液体培养基，分别加入不同菌株菌悬液，100 mL培养基加 1 mL菌悬液，分别置于 16、30、37、45℃，转速120 r/min下恒温振荡培养48 h，不同菌株同一温度下各设3个平行，于可见分光光度计600 nm下测其吸光度。

（4）重金属离子（Cr6+）对2株活性内生细菌生长的影响。取LB液体培养基配成Cr6+浓度分别为5、10、20、40、60、80 mg/L 的培养基，100 mL 培养基接入1 mL菌悬液，不同菌株同一Cr6+浓度各设3个平行，置于35℃、转速120 r/min下恒温振荡培养48 h，于可见分光光度计600 nm下测其吸光度。

2 结果与分析

2.1 无花果活性内生细菌筛选结果及其形态学特征

根据菌落形态、颜色、湿润度等特征从无花果汁中分离得到19株内生细菌，经金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和变形杆菌筛选后得到2株活性内生细菌，编号分别为3251、3252。其中：3251单菌落为圆形，表面润滑，菌落隆起，呈乳白色不透明状；3252单菌落为圆形，表面润滑，菌落隆起，呈淡黄色不透明状。二者均为典型的细菌菌落特征。革兰氏染色发现，2株内生菌均为革兰氏阳性菌，杆状。

2.2 无花果活性内生细菌16S rDNA序列测定及同源性比对结果

2株无花果活性内生细菌的16S rDNA序列片段大小均为1 500 bp左右（图1），获得序列号分别为KJ499776和KJ499777，经过NCBI数据库BLAST比对，二者均为芽孢杆菌属细菌，16S rDNA同源性比对结果如表1所示。经过生理生化特征试验，依据芽孢杆菌命名规则，分别命名为Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252。

表1 16S rDNA同源性比对结果

2.3 无花果活性内生细菌芽孢染色结果

芽孢染色发现，Bacillus WHG3251芽孢形成时间为25 h，Bacillus WHG3252芽孢形成时间为26 h。谭丽雪等[9]研究发现，1株简单芽孢杆菌芽孢形成时间为16 h，1株枯草芽孢杆菌芽孢形成时间为43 h。很多因素都会影响芽孢形成，比如营养缺乏、高浓度矿物元素、高细胞密度和辐射等都可引发营养体细胞的分化并形成芽孢。对特定的微生物而言，需要探索其合适的条件控制其芽孢的形成。本试验2株来自无花果汁的芽孢杆菌产芽孢时间有一定差异，具体机制还需要进一步深入研究。

2.4 无花果活性内生细菌活性成分检测结果

由表2可知，从无花果汁中分离筛选到的2株内生细菌经过48 h发酵培养后都能产生活性物质，确定2株芽孢杆菌是有活性的内生细菌。根据抑菌圈直径大小，Bacillus WHG3251对3株检测菌种的抑菌效果明显强于Bacillus WHG3252。说明无花果汁内存在可产生丰富多样的次级代谢产物的活性内生细菌，可考虑作为新型天然产物开发研究的菌种来源，为新药研发提供依据，本试验筛选到的Bacillus WHG3251更具有药物开发价值。

表2 无花果活性菌株发酵液活性成分抑菌效果 单位：cm

2.5 培养条件对无花果活性内生细菌生长的影响

2.5.1 培养时间对2株活性内生细菌生长曲线的影响。如图2所示，2株无花果活性内生细菌在LB培养基中的生长周期较长，并且生长变化有一定差异。其中：Bacillus WHG3251在0～60 h生长缓慢，表现为生长环境适应调整期，60 h后增长迅速，96 h时生长达到较高水平；Bacillus WHG3252对生长环境的适应时间相对较长、衰亡时间较早，72 h后生长迅速，84 h时达到生长最高水平，96 h时已经进入衰亡状态。细菌生长与细菌类型有关[10-11]，同时受生长环境的影响。尽管细菌生长曲线没有明显的衰亡期，但这并不影响生长曲线的趋势以及对菌株对数期和稳定期的判断[12]。

2.5.2 pH值对2株活性内生细菌生长的影响。培养基初始pH值是影响细菌生长及细菌群落结构的重要因素，不同细菌适宜初始pH值有差异。研究发现，大部分植物内生细菌生长最适pH值为7.0[13-14]。陈正培等[15]从百香果果浆中分离得到的3株内生细菌最适pH值均为5.5，认为与它们的存在环境有关。由图3可知：初始pH值分别为7和6时，Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252这2株无花果内生细菌菌液吸光度最高，生长最旺盛；而pH值为8时，2株内生细菌生长受到明显影响。说明Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252这2株内生细菌对碱性环境比较敏感，弱酸条件也不利于其生长，初始pH值分别以7和6最利于其生长。

2.5.3 培养温度对2株活性内生细菌生长的影响。温度对细菌生长影响显著，培养温度通过影响细胞内酶活力和细胞膜的通透性进而影响细菌的生长繁殖。由图4可知：Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252这2株无花果内生细菌在30℃时生长较好，说明2株活性内生细菌属于中温型细菌；随着培养温度升高（37℃和45℃），2株无花果内生细菌的生长受到一定影响，温度越高影响程度越大；低温（16℃）条件下，无花果内生细菌生长较缓慢。

2.5.4 重金属离子（Cr6+）对2株活性内生细菌生长的影响。微生物能吸收和转化重金属及其化合物，但是当环境中重金属浓度增加到一定程度时，就会抑制微生物的生长代谢作用甚至引起微生物死亡[16]。研究者一般认为，微生物抗金属的机制主要有生物吸附、胞外沉淀、生物转化、生物累积和外排作用[17]。已经发现很多微生物对金属铬尤其对六价铬有抗性，其中有些微生物可以把铬从高毒的六价还原成低毒的三价，具有巨大的应用潜力[18]。由图5可以看出：培养基Cr6+浓度为10 mg/L时，对Bacillus WHG3251、Bacillus WHG3252的生长有促进作用，且对Bacillus WHG3252的促进作用较明显；当Cr6+浓度超过20 mg/L时，对2株无花果内生细菌的生长都有抑制作用，高浓度Cr6+条件下2株无花果活性内生细菌有微弱生长。重金属促进微生物生长的能力称为毒物兴奋效应[19]。铬诱导可使SOD等含量显著增加，提高活性内生细菌抗氧化能力，降低铬胁迫导致的活性氧伤害[20]，因而一定浓度的重金属离子处理会表现出对活性内生细菌的生长有促进作用。

3 结论与讨论

本试验从无花果汁中筛选到2株活性内生细菌，通过提取DNA和PCR扩增后碱基测序、NCBI数据库比对，发现2株活性内生细菌均为芽孢杆菌属细菌；经生理生化验证后，将2株活性内生细菌分别命名为Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252；芽孢染色后发现，Bacillus WHG3251芽孢形成时间为25 h，Bacillus WHG3252芽孢形成时间为 26 h；革兰氏染色结果表明，2株活性内生细菌均为革兰氏阳性菌，杆状；发酵培养后，2株无花果活性内生细菌均有活性物质产生，可作为新药物开发研究的资源库，其中Bacillus WHG3251产生的活性物质的抑菌效果强于Bacillus WHG3252。对2株无花果活性内生细菌进行生长条件优化研究发现：2株活性内生细菌生长时间有一定差异，Bacillus WHG3251在96 h时生长达到较高水平，Bacillus WHG3252在84h达到最高水平、96 h时已经进入衰亡期；Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252这2株活性内生细菌生长最适pH值分别为7和6；2株活性内生细菌均为中温菌，最适生长温度为30℃；重金属离子（Cr6+）对2株活性内生细菌生长的影响较明显，Cr6+浓度为10 mg/L时对其生长表现出较强的促进作用，Cr6+浓度大于20 mg/L时表现为抑制作用。