基于网络药理学和分子对接技术探讨五味子治疗慢性咳嗽的机制研究

林 豪，王 阔，曾钦成，李 贺，王春梅，陈建光，孙靖辉

(北华大学药学院，吉林 吉林 132013)

咳嗽是呼吸道的反射作用，具有清除呼吸道异物和分泌物的保护性功能.根据咳嗽持续时间的长短，人们将咳嗽分为急性咳嗽、亚急性咳嗽以及慢性咳嗽，其中慢性咳嗽的持续时间通常大于8周[1].慢性咳嗽的病因难以确定，并且目前仍然缺乏有效、可接受的治疗策略[2].因此，有必要继续研究其发生机制以及开发针对性强的治疗药物.

五味子(Schisandrachinensis)是木兰科植物五味子的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》中，列为上品，是享誉中外的滋补性中药[3].研究[4-5]表明：五味子中主要含有木脂素、挥发油、萜类等活性成分，具有保肝、助睡眠、抗焦虑、抗氧化衰老等功效，基于五味子确切的保健功效和安全性，国家卫生部已于2002年将其列入《可用于保健食品的物品名单》中，以充分开发其药用保健价值.

历代众多医家对五味子的敛肺止咳作用大为推崇，将其列为“止咳要药”[6].近年来，多是从五味子整体或某一大类成分研究五味子治疗咳嗽的作用机制，对于详细的五味子单体成分治疗咳嗽的研究较少，其发挥镇咳作用的机制也未能明确[7-9].因此，本研究拟采用网络药理学筛选五味子治疗咳嗽的核心成分和关键靶点，再通过分子对接技术模拟核心成分和关键靶点的结合情况，从而探究五味子治疗咳嗽的有效成分和潜在作用机制.

1 材料与方法

1.1 五味子活性成分的筛选

利用Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform 平台(TCMSP，http：∥tcmspw.com/tcmsp.php)筛选五味子活性成分.根据ADME相关参数(口服利用度，OB≥30%；类药性，DL≥0.18)筛选五味子的潜在活性成分，最后得到五味子有效成分的集合[10].

1.2 五味子作用靶点的获取

利用TCMSP数据库结合UniProt 数据库(http：∥www.uniprot.org/)获取五味子的作用靶点.将筛选出的有效成分在TCMSP数据库上查询其相关靶点，并通过UniProt 数据库进一步将靶基因的全名标准化校正成该基因的符号，最终得到五味子作用靶点的集合.

1.3 咳嗽作用靶点的筛选

利用Therapeutic Targets Database(TTD，http：∥db.idrblab.net/ttd/)、DisGeNET (http：∥www.disgenet.org)和 DrugBank(https：∥www.drugbank.ca)数据库检索咳嗽相关靶点，进行标准化校正以获得咳嗽作用靶点的集合.

1.4 筛选五味子与咳嗽相关交集靶点

通过软件Venny 2.1.0(http：∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)构建五味子与咳嗽相关交集靶点的韦恩(Venn)图，从而获得五味子与咳嗽的相关交集靶点.

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络图的构建

将获得的交集靶点导入到String(https：∥string-db.org/)平台上，构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络模型.隐藏网络中断开的节点，导出PNG格式的高清PPI网络图和TSV文件，并将TSV文件导入到Cytoscape 3.8.2软件中进行拓扑分析，获取PPI网络的核心基因直方图.

1.6 构建成分-交集靶点网络图

利用软件Cytoscape 3.8.2(https：∥cytoscape.org/)构建成分与交集靶点之间的关系网络.

1.7 交集靶点的富集分析

利用Webgestalt 网站(http：∥www.webgestalt.org)对交集靶点进行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)的富集分析.

1.8 成分-关键靶点分子对接

从RCSB PDB数据库(https：∥www.rcsb.org/)下载关键靶点的三维(3D)化学结构.利用PubChem数据库(https：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载五味子核心成分的化学结构.Chem3D软件用于创建三维化学结构并最小化其能量，然后在AutoDock Tools 1.5.6软件中以PDBQT格式作为对接配体保存.利用AutoDock Tools 1.5.6软件对关键靶点进行处理，包括去水、加氢、氨基酸优化和修补，再以PDBQT格式导出作为受体保存，最后，利用Autodock Vina 1.1.2分别将受体蛋白与五味子核心成分进行对接.对接结果中，每组共生成20个构象，选择亲和力最好的构象作为最终的对接构象，并在Pymol 1.8中进行可视化.有报道[11]显示：结合能越小表明配体越易于与受体自由结合，本研究选择结合能≤-5.0 kJ/mol为条件对五味子核心成分与关键靶点的对接情况进行验证.

2 结 果

2.1 五味子活性成分中相关作用靶点的筛选

通过TCMSP数据库检索，共筛选出五味子8个有效活性成分(见表1)，从这8个有效活性成分中筛选出877个五味子作用靶点.

表1 五味子有效活性成分信息

2.2 五味子活性成分作用咳嗽的靶点筛选

对TTD、DisGeNET和DrugBank数据库的检索结果进行汇总，得到331个相关基因靶标；通过Venn图获取到五味子作用靶点与咳嗽作用靶点的集合，共得到88个交集靶点(见图1).

2.3 PPI网络的构建与筛选关键靶点

将筛选得到的88个交集靶点导入到String网络平台上，构建PPI网络图(见图2).图2中共有87个节点，965条边，平均节点度值为22.2.在PPI网络图中，节点之间的连接数称为“度”，度值越高，表明该节点在网络中越重要.使用Cytoscape软件筛选出PPI网络中节点度值最多的前10个基因，并构建直方图(见图3)，结果表明：Akt1和Tnf为度值最高的基因，最有可能是治疗咳嗽的关键靶点.成分-交集靶点网络图的构建更直观地反映五味子活性成分与交集靶点之间的关系(见图4)，再结合2.1中TCMSP筛选结果，提示Akt1和Tnf是戈米辛R(Gomisin R，GSR)和戈米辛A(Gomisin A，GSA)的作用靶点，最终选择GSR和GSA作为五味子治疗咳嗽的核心成分.

2.4 KEGG和GO的富集分析

利用Webgestalt网站对关键靶点进行KEGG富集分析，筛选得到27条通路(FDR(False discovery rate，容错率)<0.05)，涉及FcεRI信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll样受体信号通路等，最后将P值较小的前10个通路进行可视化(见图5).结果表明：FcεRI信号通路的P值相对较小，可信度较高，并且该通路同时涉及Akt1和Tnf靶点，可以认为该信号通路是五味子治疗咳嗽的核心通路.

图5 关键靶点的KEGG通路富集分析

GO富集分析得到GO条目205个(P<0.05)，其中生物过程(BP)条目102个(主要包括阴离子跨膜转运的负调控、细胞表面蛋白质定位的正向调节等)，细胞组成(CC)51个(主要包括吞噬杯、囊泡等)，分子功能(MF)52个(主要包括一氧化氮合酶调节活性、GTP酶激活蛋白结合等)，分别占50%、25%、25%，排名前10位的条目见图6.

BP.生物过程；CC.细胞组成；MF.分子功能.

2.5 五味子核心成分作用于关键靶点的分子对接结果

通过分子对接来验证五味子核心成分是否在镇咳关键靶点Akt1和Tnf中发挥作用.通常认为配体与受体的结合能越低，结合构象就越稳定，配体与受体自发性结合的可能性就大.见表2.五味子核心成分与Akt1和Tnf均具有较强的亲和力，GSA与Akt1的氨基酸残基GLU-49、ARG-328和ASP-325通过4个氢键相结合，使GSA与Akt1形成稳定的复合物(见图7 a)；GSA通过3个氢键结合Tnf的3个氨基酸残基THR-7、LEU-37和ALA-35，表现出紧密的结合模式(见图7 b)；GSR则利用TRP-80与Akt1相结合(见图7 c)；GSR通过2个氢键与Tnf的LEU-26和GLN-27结合(见图7 d).由此可知，五味子中的核心成分能够与关键靶点形成能量低、结构稳定、结合活性较强的对接构象.

表2 五味子核心成分与关键靶点的对接能量

a.GSA与Akt1对接形成的3D结构；b.GSA与Tnf对接形成的3D结构；c.GSR与Akt1对接形成的3D结构；d.GSR与Tnf对接形成的3D结构.图中黄色虚线代表氢键.

3 结 论

五味子味酸收敛、甘温而润、上敛肺气、下滋肾阴，已广泛用于治疗慢性咳嗽的中药处方中[12].中药成分复杂，治疗疾病多通过多靶点、多途径作用来实现，传统研究方法很难完全阐明其作用机制.网络药理学作为传统中医和现代医学的桥梁，能够将二者有机结合，通过构建多元化网络探究药物中各成分与治疗靶点之间的交互作用，使中药的作用机制从分子水平解释成为可能[13].本实验运用网络药理学构建多个相互联系的网络，并从中筛选出关键靶点，富集分析关键靶点的通路以及生物学过程，再利用分子对接技术架构药物活性成分和靶点蛋白的结合构象，系统地探究五味子治疗咳嗽的潜在作用机制.

本研究通过TCMSP平台筛选出8个五味子有效活性化合物，877个五味子相关靶点，利用TTD、DisGeNET和 DrugBank数据库收集咳嗽相关靶点共331个.两个靶点集交互整合得到88个交集靶点，通过构建网络图及拓扑分析进一步得到Akt1和Tnf两个关键靶点.结合TCMSP筛选结果及成分-交集靶点网络图，提示GSA和GSR是与关键靶点作用最为密切的核心成分.

FcεRI通路是KEGG富集分析筛选得到的与咳嗽密切相关的信号通路，而PI3K/Akt是该通路中的重要因子.已有报道[14]指出，TRPV1受体在慢性咳嗽患者的支气管中表达增加，在咳嗽感受器上的TRPV1通道可以通过诱发气道神经源性炎症增加咳嗽敏感性.PI3K-Akt信号通路可调节细胞分裂、分化、迁移等生理过程，具有促进细胞生存、细胞自噬及抗凋亡的作用[15].研究[16]发现，PI3K-Akt信号通路可通过调节PI3K/Akt信号通路使TRPV1表达下调.MAPK通路是FcεRI信号通路的下游信号通路，与细胞凋亡和神经炎症均密切关系，有研究[17-18]报道，该通路可通过调控MPAK信号通路上P38、Akt等炎症信号的表达减轻神经炎症反应，从而降低咳嗽敏感性.在分子对接的验证中发现，GSA和GSR能通过氢键紧密地结合相关靶点蛋白，表现出较强的亲和力，提示五味子可能通过调控Akt1和Tnf在信号通路中的表达，改善咳嗽敏感性.

综上，本研究通过网络药理学分析方法预测了五味子治疗咳嗽的有效成分及潜在靶点，探讨了五味子可能通过多靶点、多通路来调节咳嗽敏感性、神经源性炎症等生物学过程，从而发挥镇咳作用，并运用分子对接技术证实核心成分GSA和GSR与关键靶点蛋白Akt1和Tnf具有较强的亲和力，为后续深入探究五味子治疗咳嗽的机制以及五味子药物的开发提供了新的思路与方向.