北五味子多糖对人膀胱癌细胞体外增殖和凋亡作用的研究

孙红霞，刘春旭，安学俊，崔光华，王靖宇，佟双喜，杨晓秋

(1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013，2.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

膀胱癌是泌尿系统位列第一的恶性肿瘤，膀胱癌在临床上的治疗方法主要为经尿道膀胱肿瘤电切术(TUR-Bt)，但术后5 a复发率高达60%～70%，且有25%左右的患者复发后会进展为浸润性膀胱癌[1].临床上为防止患者术后复发，常辅以膀胱灌注(免疫抑制剂或化疗药物)，但均存在不同程度的全身或局部毒副反应，且仍有20%左右的患者虽经膀胱灌注治疗但肿瘤仍会复发[2].而根治性膀胱切除术加尿流改道术后仍有高达50%的患者可能出现转移，且对转移性膀胱癌患者采用的化疗方案疗效不能持久，患者5 a生存率仅为20%～40%[2].鉴于目前膀胱癌灌注药物及化疗药物疗效的不稳定性及其显著的毒副作用，寻找安全有效、来源于天然产物的抗肿瘤药物是近年来肿瘤药物研发的热点.

五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物，五味子多糖(SCP)是从五味子中提取出来的，具有多种生物学活性，如保肝、增强免疫、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用，特别是其抗肿瘤活性日益受到广泛关注[3-5]，SCP抗肿瘤作用已经明确，但有关其抑制膀胱癌细胞生长抑制的作用迄今国内外尚未见报道.鉴于课题组前期筛选五味子功效成分时观察到其可能对膀胱癌有一定抑制作用，但未做深入研究，因此，本实验拟观察SCP对体外生长膀胱癌细胞的抑制作用并探讨其作用机制，为五味子深度开发利用和探索研制抗膀胱癌作用的中药新药提供药理学基础.

1 材料与方法

1.1 材 料

北五味子多糖由吉林省五味子开发及产业化科学研究中心制备.首先通过超临界CO2流体萃取，将北五味子中水溶性成分和脂溶性成分分离，然后利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈空化效应及搅拌作用，经超声波预处理40 min后进行浸提，再经酶法与三氯乙酸结合脱蛋白得北五味子粗多糖，提取率为77.6%，纯度可达50%以上.

人膀胱癌T24细胞株(上海慧颖生物科技有限公司)；细胞培养基DMEM(批号：12100046，Gibco公司，美国)；胎牛血清(批号：SH30396.03，Hyclone公司，美国)；胰蛋白酶 (批号：25200-056，Gibco公司，美国)；MTT(批号：11465007001，Sigma公司，日本)；Annexin V-FITC流式细胞凋亡检测试剂盒(批号：E-CK-A111，武汉伊莱瑞特生物科技公司)；β-actin(批号：sc-69879)、PTEN(批号：sc-377573)、PI3K、p-PI3K(批号：sc-365290)、AKt、 p-Akt(批号：sc-5298)、一抗鼠抗人、二抗兔抗鼠(Santa cruz公司，美国)；CO2培养箱(BBD6220，Hyclone公司，美国)；酶标仪(MR-96A，武汉迈瑞科技有限公司)；高速冷冻离心机(Avanti J-15R，贝克曼公司，美国)；凝胶成像系统(Invitrogen，E-Gel Imager，Hyclone公司，美国)；奥林巴斯倒置显微镜(CKX53，奥林巴斯株式会社，日本)；其余试剂均为国产分析纯.

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养

人膀胱癌细胞T24细胞株在含10%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养液中，于37 ℃，含5%CO2细胞的培养箱中培养.实验使用细胞均为接种后24 h处于对数生长期的细胞.

1.2.2 分组及处理

实验设空白对照组和SCP 50、100、200 μg/mL 3个不同剂量实验组.取对数生长期的T24细胞3×104/mL 接种于培养瓶中培养，24 h后加入不同浓度的 SCP(50、100、200 μg/mL)，作用48 h后胰酶消化、离心，将细胞悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中备用.

1.2.3 MTT法检测细胞增殖

取对数生长期膀胱癌T24细胞，用胰酶消化后，以4×103/孔接种于96孔板培养24 h，然后加入SCP，使其终浓度分别为0(即未加药)、50、100、200 μg/mL；培养0(即细胞接种于96孔板24 h后)、48 h后，再加入5 mg/mL MTT，20 μL/孔，孵育4 h，弃上清液；加DMSO 150 μL/孔，避光振荡10 min.同时设空白对照组，用酶联免疫检测仪检测吸光度OD490nm值.细胞增殖抑制率计算：抑制率(IR)=[1-(A值(实验孔)-A值(空白孔))/(A值(对照孔)-A值(空白孔)]×100%.

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期

SCP作用24 h后，收集空白对照组和SCP不同浓度组的T24细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液.用PBS洗涤1次，细胞沉淀用预冷的70%乙醇在-20 ℃固定过夜.取固定后的细胞用PBS洗涤2次并悬浮之，加入终浓度为50 mg/L的核糖核酸酶A(RNaseA)36 ℃水浴30 min，再加入800 μL碘化丙啶(PI)染液至终浓度为50 mg/L，摇匀后4 ℃避光静置30 min，200目尼龙网过滤.应用流式细胞仪分析细胞周期及凋亡情况，低于G1期DNA含量细胞为凋亡细胞.

1.2.5 Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡

将对数生长期T24细胞按3×105/孔接种于6孔板，细胞贴壁融合60%～70%后，吸出孔内培养基，加入SCP使其终浓度分别为0(空白对照组)、50、100、200 μg/mL，继续培养48 h后，吸尽孔内培养基，加入0.5 mL固定液，10 min后去固定液，用PBS洗2次，加入0.5 mL Hoechst33258染色液，避光染色5 min.在倒置荧光显微镜下观察细胞核形态(激发波长350 nm，发射波长460 nm)，了解细胞凋亡情况.实验重复3次.

1.2.6 Western blot法检测蛋白表达

收集不用浓度SCP处理48 h的T24细胞，提取蛋白质后BCA法测定其总蛋白含量.分别取各组40 μg总蛋白上样，随后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，加入适量稀释的Bax、 Bcl-2 (1∶1 000)、 cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、β-actin (1∶1 000)一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶500)，室温下摇荡孵育2 h；采用ECL发光液发光，与发光试剂充分反应后，应用分析软件分析各显影条带的A值(p-Akt与Akt的比值)、各目标蛋白与β-actin的比值.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 MTT法检测SCP对细胞增殖及抑制率的影响

不同剂量的SCP均能抑制T24细胞的OD值，SCP干预后，OD值呈下降趋势，SCP作用后OD值与对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05及P<0.01).SCP各组抑制率分别为18.69%、39.13%及64.76%.见表1.

表1 MTT法检测SCP对细胞增殖抑制率的影响

2.2 倒置显微镜下观察T24细胞形态学的改变

使用相差显微镜观察细胞形态学变化.在用SCP 50、100、200 μg/mL处理前列腺癌T24细胞24 h后，直接置于显微镜下观察，可见处理后的细胞数量明显减少，出现细胞凋亡形态学变化，细胞体积缩小、皱缩、变圆，与周围细胞脱离，死细胞呈明亮的圆形，与对照组比较，活细胞数量明显减少.见图1.

图1 SCP对膀胱癌细胞形态学影响(×40)

2.3 FCM检测SCP对细胞周期分布(凋亡峰)的影响

前列腺癌T24细胞经SCP不同浓度处理48 h后，流式细胞仪检测可见在G1期峰前出现一个亚二倍体峰，说明不同浓度SCP能引起T24细胞的凋亡，SCP 3个组的细胞凋亡率分别为28.73%、38.35%和60.52%，与对照组比较有显著性差异(P<0.05).同时，SCP高剂量组影响了T24细胞的生长周期分布，G0/G1期的T24细胞最高达80.71%，与对照组比较，T24细胞G0/Gl期的细胞数目明显增多，而S期和G2/M期细胞数目减少，即SCP使T24细胞生长阻滞在G0/G1期，从而诱导了细胞凋亡的发生.见图2.

组别与对照组比较，*.P<0.05，#. P<0.01.

2.4 Hoechst 33258荧光法检测SCP对膀胱癌细胞凋亡的影响

荧光显微镜下可以清晰地观察到细胞核内染色质的固缩与断裂，呈现出典型的细胞凋亡学形态特征.图3 b、d可看到固缩的细胞核，细胞核皱缩是细胞凋亡最明显的特征之一，SCP能够使T24细胞核严重皱缩，诱导细胞凋亡.与对照组比较，SCP干预组随剂量增加出现凋亡数目的细胞明显增多(P<0.05).见图3.

图3 Hoechst 33258 荧光染色观察SCP对T24细胞凋亡的影响(×400)

2.5 WB检测SCP对凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

与空白对照组比较，各给药干预组Bcl-2蛋白表达逐渐减少，Bax蛋白表达逐渐增加(P<0.05)；与空白对照组比较，cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的蛋白表达量随SCP剂量增加而逐渐增加(P<0.05)，呈现明显的量效关系.见图4(a、b、c、d、e).

图4 Western blot检测SCP对Bcl-2，Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表达的影响

3 讨 论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占我国泌尿生殖系统肿瘤发病率的第一位，2014年统计显示其发病率为6.61/10万，在恶性肿瘤发病率中占第九位[6-8].流行病学研究[9]表明：化学致癌物是膀胱癌的致病元凶，如存在于烟草中的芳香胺类化合物等，与膀胱癌相关的癌基因有H-Ras、BcL-2、c-erbB-2等[9]，与膀胱癌细胞凋亡相关的基因主要有死亡受体基因家族、Bcl-2基因家族、Caspase基因家族.Bcl-2基因家族包括Bad、Bcl-2、Bcl-xL等基因，有些基因具有抗凋亡作用，如Bcl-2等；有的基因具有促凋亡作用，如Bax等.Bax与Bcl-2的功能相反，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白.Bcl-2蛋白和Bax蛋白能够形成二聚体，这两种蛋白的比值调控细胞的凋亡，Bcl-2/Bax比值增高时抑制细胞凋亡，比值降低时促进细胞凋亡.

细胞凋亡途径有线粒体途径、内质网途径、死亡受体途径.Caspase家族(cysteinyl aspeantate-specific proteinase family)是指一群含有半胱氨酸的蛋白酶，在凋亡执行过程中起着至关重要的作用，而且细胞凋亡的过程实际上是Caspase被活化并发生凋亡蛋白酶的级联反应[10].半胱氨酸蛋白酶家族有14 名成员，Caspase-3、9均参与细胞凋亡，Caspase介导凋亡的第一个途径是线粒体途径，涉及Caspase-9，这一过程需要Caspase-9的激活[11-13]，Caspase-3处于细胞凋亡的下游，是凋亡级联反应中最关键的酶之一，是凋亡的终结执行者之一.Caspase-3 是参与细胞凋亡的关键蛋白酶，通常情况下，Caspase-3以没有活性的酶原形式(pro-Caspase-3)存在于胞浆中.凋亡发生时，pro-Caspase-3被激活，表现为激活型，即cleaved Caspase-3.有研究[14-15]表明，Caspase-3与Bcl-2相互作用促进了细胞凋亡的发生.

五味子是我国常用的一种传统中药，有多种生物学活性.SCP是五味子作用的主要成分之一，主要组成成分有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖等.本研究结果发现：SCP能够抑制膀胱癌细胞的体外增殖作用，3种剂量的SCP干预作用结果与对照组比较，差异明显(P<0.05).形态学观察结果显示：SCP作用后，能明显地诱导T24细胞出现凋亡，出现细胞核固缩或胞质化，与后面的促凋亡结果相一致.细胞周期是反映细胞增殖是否活跃的指标，SCP作用后，可使细胞S期比例减少，G0/G1期比例增加，G2/M相应下降，说明SCP能够阻止T24细胞的增殖作用.SCP诱导凋亡峰值出现，凋亡率明显升高，与对照组比较有明显差异(P<0.05).凋亡是由一系列凋亡基因参与的过程，其中Bax、Bcl-2在凋亡过程中起重要作用，Bax、Bcl-2相互作用改变线粒体膜通透性，促进CytC释放，激活Caspase-9启动凋亡进程，进而激活Caspase-3[16-17].本研究结果显示：SCP能够明显升高促凋亡基因Bax蛋白表达，降低Bcl-2抗凋亡基因蛋白表达，使二者比例发生改变，起到促进凋亡作用.作为Caspase-9的下游基因，与Caspase-3共同参与了线粒体的凋亡途径，即Caspase-9激活了Caspase-3，再通过ROCK启动细胞凋亡的发生.作为Akt的下游信号，Caspase-9、Caspase-3在凋亡中的作用十分关键，SCP能够促进二者的激活，使cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3的蛋白表达增加，最终启动T24细胞凋亡.

因此，SCP能够抑制T24细胞增殖，促进其凋亡，其作用可能与激活促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9启动凋亡过程，促进下游基因bcl-2活化，SCP通过调控细胞周期、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡作用最终抑制癌症的发生.