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响应面法超声辅助提取银杏叶浸膏工艺优化

2022-08-17杜东雨杨东昆付钰涓王子琪李洪宇徐广宇

关键词:浸膏固液银杏叶

杜东雨,杨东昆,付钰涓,王子琪,李洪宇,徐广宇

(1.北华大学药学院,吉林 吉林 132013;2.吉林市中心医院,吉林 吉林 132011)

银杏(GinkgobilobaL.)属银杏科银杏属植物,别名公孙树,分布遍及我国27个省市区,系中国特产树种,世界其他国家多有引种[1].银杏作为药用植物至今已有600多年历史,药用部分主要是果及叶,目前研究多在银杏叶利用上[2].银杏叶中含有多种生物活性成分,包括黄酮类化合物、多糖类化合物、萜类化合物和有机酸等[3],其提取物已被证实具有多种药用和药理学特性,经常用于治疗神经系统、心血管和呼吸系统疾病[4-6].

银杏叶浸膏是银杏叶提取物前体,常用的提取方法有溶剂萃取法、超声波提取法及超临界流体萃取法等[7].我国主要采用醇水溶剂加热回流法提取银杏叶浸膏,再经大孔树脂吸附纯化制得银杏叶提取物[8],但提取率低,所得提取物含量也不高,且原料生产成本较高.本文采用的超声波溶剂萃取法,是近年来兴起的一种现代提取技术,该方法利用超声波一系列物理、化学效应,有效破坏植物细胞壁,快速萃取生物有效成分[9-11],具有能耗低、易放大和节省时间等优点.本研究以银杏叶浸膏得率为目标,采用超声波辅助乙醇溶液进行提取[12],通过Box-Behnken星点响应面法[13-14]优化乙醇体积分数、超声时间、固液比,确定超声波法提取银杏叶浸膏的最佳工艺条件,以提高银杏叶浸膏得率.同时,以黄酮含量为标准,与传统方法进行比较.

1 试验方法

1.1 试验材料与试剂

银杏叶购自河北金叶子药业有限公司;芦丁标准品购自中国食品药品检定研究院;无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等均为分析纯,购自天津市风船化学试剂科技有限公司.

1.2 仪 器

DE-500g粉碎机,红景天有限公司;UV-2550 紫外可见分光光度计,岛津国际贸易有限公司;THC-20C型超声机,济宁天华超声电子仪器有限公司;循环水式多用真空泵;AL204电子天平,METTLER TOLEDO;GZX-9140ME数显鼓风干燥箱,上海沪西分析仪器厂;RE-52AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂.

1.3 试验方法

1.3.1 银杏叶浸膏提取

以银杏叶药材为原料,经干燥、粉碎后过筛(80目).

1)超声辅助乙醇溶剂提取法.准确称量银杏叶粉末置于锥形瓶中,经超声辅助乙醇溶剂提取、过滤、浓缩、干燥、粉碎得干膏粉.出膏率=(干膏粉得量/投药材总量)×100%.

2)索氏提取法.取银杏叶粉末5.0 g,用50%乙醇溶液进行索氏提取10 h.提取液过滤,经浓缩、干燥、粉碎得干膏粉.

3)黄酮含量测定.采用紫外分光光度法中的“亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法”测定银杏叶浸膏中黄酮含量.用紫外可见分光光度仪检测样品在510 nm 处的吸光度,每个样品平行测定 3 次.以芦丁体积质量(μg/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线[14].标准曲线回归方程:y=0.082 9x+0.000 1,R2=0.999 5.

1.3.2 超声辅助单因素试验

分别称取干燥粉碎后的银杏叶1 g,超声功率150 W.

1)在室温条件下,乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,超声提取30 min,考察乙醇体积分数对银杏叶浸膏得率的影响.

2)在乙醇体积分数为50%的条件下,将提取时间设定为20、30、40、50、60 min,考察超声时间对银杏叶浸膏提取得率的影响.

3)在乙醇质量数为50%,提取时间为40 min的条件下,设定固液比(g∶mL)分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,考察固液比对于银杏叶浸膏提取得率的影响.

1.3.3 Box-Behnken响应面试验

根据Box-Behnken星点响应面试验设计原理,以浸膏得率为响应值,优化乙醇体积分数、提取时间、固液比.水平试验设计见表1.

表1 响应面试验设计

2 结果与讨论

2.1 单因素对银杏叶浸膏得率的影响

2.1.1 乙醇体积分数的影响

乙醇体积分数对银杏叶浸膏得率的影响见图1.由图1可知:浸膏得率随乙醇体积分数的增大呈先升后降的趋势,在乙醇体积分数为50%时浸膏得率达到峰值,为24.38%.之后,随着乙醇体积分数的继续增加,浸膏得率先下降后再次上升,在乙醇体积分数为80%时,浸膏得率为23.50%,再次达到顶点,此后浸膏得率随乙醇体积分数的继续升高迅速下降.比较乙醇体积分数为50%和80%时的浸膏得率,选定最佳乙醇体积分数为50%.

2.1.2 提取时间的影响

提取时间对浸膏得率的影响见图2.由图2可知:银杏叶浸膏提取得率随着提取时间的增加呈递增趋势,在提取时间为40 min时,银杏叶浸膏提取得率达到最大;提取时间在40~60 min时,提取得率呈现略有下降的趋势.因此,确定最佳提取时间为40 min.

2.1.3 固液比的影响

固液比对浸膏得率的影响见图3.由图3可知:浸膏得率在固液比为1∶40前随着固液比的提高逐渐升高,在固液比为1∶40(g∶mL)时达到最高;之后,随固液比的提高,得率缓慢下降.分析原因,可能是固液比增大,导致溶液浓缩时间延长,浸膏得率下降.因此,确定最佳固液比为1∶40(g∶mL).

图3 固液比对浸膏得率的影响

2.2 Box-Behnken试验结果及分析

2.2.1 Box-Behnken试验结果

响应面试验共设计19个试验点,选择乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、固液比(C)3个因素,试验设计及结果见表2.通过分析得到多元二次回归方程,其回归模型为

表2 响应面试验设计及结果

y=24.48-0.075A+0.18B+0.40C+0.062AB+0.51AC+0.073BC-2.10A2-1.17B2-0.77C2.

表2(续)

回归模型方差分析结果见表3.由表3可知:以银杏叶浸膏含量为响应值时,模型P<0.000 1,说明该回归方程拟合度较好且具有统计学意义.模型失拟项P为0.608 0,大于0.050 0,表明差异不显著,说明未知因素对试验结果干扰很小,该模型能充分反映实际情况[15].确定系数R2为0.997 1,说明99.71%的数据可用此方程解释.各因素对浸膏提取得率的影响依次为固液比(C)>提取时间(B) >乙醇体积分数(A),交互项AC为模型中的显著因素.

表3 回归模型方差分析

2.2.2 响应面分析

利用响应面分析图可以评价试验因素两两之间的交互作用.通过 Box-Behnken试验得到的响应面图形见图4~图6.响应面图形是在其他试验条件、环境等因素固定的情况下,考察交互项对银杏叶浸膏得率的影响,当等高线呈现近似圆形时,表示两因素之间的交互作用不显著;当等高线呈现椭圆形时,表示两因素之间的交互作用显著[16].由图4、6可知:乙醇体积分数和提取时间、提取时间和固液比交互项的等高线图均近似为圆形,说明交互项的交互作用均不显著;由图5可见:乙醇体积分数与固液比的等高线图呈现椭圆形,说明乙醇体积分数与固液比的交互作用显著,这一结果与表3结果一致.

图4 乙醇体积分数和提取时间的曲面和等高线

图5 乙醇体积分数和固液比的曲面和等高线

图6 提取时间和固液比的曲面和等高线

2.3 验证试验

依据研究结果可知:银杏叶浸膏提取最佳条件为乙醇体积分数50.15%,提取时间40.85 min,固液比1∶42.66(g∶mL),在此条件下的浸膏得率预测值可达24.5%.结合实验室实际条件及试验可操作性,对银杏叶浸膏得率进行验证.将提取条件修正为乙醇体积分数50%,提取时间41 min,固液比1∶43(g∶mL),进行3次平行试验,浸膏得率分别为24.8%、24.9%、25.0%,验证试验浸膏提取得率平均值为24.9%,达到了星点响应面法回归模型预测值的101.6%,由此说明,该模型能够较好地模拟和预测银杏叶浸膏得率.

3 结 论

本研究以银杏叶为对象,在单因素试验的基础上,采用Box-Benhnken星点响应面分析法优化超声辅助溶剂萃取银杏叶浸膏的提取工艺.结果表明:在乙醇体积分数为50%,提取时间为41 min,固液比为1∶43 (g∶mL)条件下,银杏叶浸膏得率最高,可达到24.9%.传统的银杏叶浸膏提取工艺在乙醇体积分数为50%微沸的情况下,浸膏得率为19.0%,黄酮含量2.5%;通过对银杏叶浸膏提取工艺优化,在乙醇体积分数为50%的情况下,显著提高了银杏叶浸膏得率(24.9%)及银杏叶中黄酮含量(3.5%).

响应面法研究结果显示:固液比和乙醇体积分数交互项对银杏叶浸膏得率的影响非常显著,这说明乙醇体积分数在银杏叶浸膏提取中起到了非常重要的作用,可能是过高的乙醇体积分数导致物质析出,进而影响得率.同时,我们也发现,在银杏叶浸膏提取工艺的3个影响因素中,固液比对银杏叶浸膏得率的影响最大,其次是提取时间和乙醇体积分数,可能的原因是超声波能有效破坏植物细胞壁,快速萃取生物有效成分,随着固液比增大,生物有效成分能快速溶出;但在固液比高于1∶40(g∶mL)以后,浸膏得率会随固液比的提高缓慢下降,其原因可能是由于固液比增大,导致溶液浓缩时间延长,浸膏提取得率受到影响.

综上所述,在银杏叶浸膏提取过程中,要特别注意控制乙醇体积分数和固液比,这两个因素对浸膏得率影响很大.本研究通过响应面法对银杏叶浸膏提工艺进行优化,可以有效提高银杏叶浸膏及有效成分的提取率,这对于银杏叶的进一步综合利用具有重要意义.银杏叶浸膏中含多种有效药物成分,具有多方面的药理和临床作用,随着药物开发“绿色浪潮”的到来[17],开发利用银杏叶等自然植物将成为趋势.

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