响应面法超声辅助提取银杏叶浸膏工艺优化

杜东雨，杨东昆，付钰涓，王子琪，李洪宇，徐广宇

(1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013；2.吉林市中心医院，吉林 吉林 132011)

银杏(GinkgobilobaL.)属银杏科银杏属植物，别名公孙树，分布遍及我国27个省市区，系中国特产树种，世界其他国家多有引种[1].银杏作为药用植物至今已有600多年历史，药用部分主要是果及叶，目前研究多在银杏叶利用上[2].银杏叶中含有多种生物活性成分，包括黄酮类化合物、多糖类化合物、萜类化合物和有机酸等[3]，其提取物已被证实具有多种药用和药理学特性，经常用于治疗神经系统、心血管和呼吸系统疾病[4-6].

银杏叶浸膏是银杏叶提取物前体，常用的提取方法有溶剂萃取法、超声波提取法及超临界流体萃取法等[7].我国主要采用醇水溶剂加热回流法提取银杏叶浸膏，再经大孔树脂吸附纯化制得银杏叶提取物[8]，但提取率低，所得提取物含量也不高，且原料生产成本较高.本文采用的超声波溶剂萃取法，是近年来兴起的一种现代提取技术，该方法利用超声波一系列物理、化学效应，有效破坏植物细胞壁，快速萃取生物有效成分[9-11]，具有能耗低、易放大和节省时间等优点.本研究以银杏叶浸膏得率为目标，采用超声波辅助乙醇溶液进行提取[12]，通过Box-Behnken星点响应面法[13-14]优化乙醇体积分数、超声时间、固液比，确定超声波法提取银杏叶浸膏的最佳工艺条件，以提高银杏叶浸膏得率.同时，以黄酮含量为标准，与传统方法进行比较.

1 试验方法

1.1 试验材料与试剂

银杏叶购自河北金叶子药业有限公司；芦丁标准品购自中国食品药品检定研究院；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等均为分析纯，购自天津市风船化学试剂科技有限公司.

1.2 仪 器

DE-500g粉碎机，红景天有限公司；UV-2550 紫外可见分光光度计，岛津国际贸易有限公司；THC-20C型超声机，济宁天华超声电子仪器有限公司；循环水式多用真空泵；AL204电子天平，METTLER TOLEDO；GZX-9140ME数显鼓风干燥箱，上海沪西分析仪器厂；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂.

1.3 试验方法

1.3.1 银杏叶浸膏提取

以银杏叶药材为原料，经干燥、粉碎后过筛(80目).

1)超声辅助乙醇溶剂提取法.准确称量银杏叶粉末置于锥形瓶中，经超声辅助乙醇溶剂提取、过滤、浓缩、干燥、粉碎得干膏粉.出膏率=(干膏粉得量/投药材总量)×100%.

2)索氏提取法.取银杏叶粉末5.0 g，用50%乙醇溶液进行索氏提取10 h.提取液过滤，经浓缩、干燥、粉碎得干膏粉.

3)黄酮含量测定.采用紫外分光光度法中的“亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法”测定银杏叶浸膏中黄酮含量.用紫外可见分光光度仪检测样品在510 nm 处的吸光度，每个样品平行测定 3 次.以芦丁体积质量(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[14].标准曲线回归方程：y=0.082 9x+0.000 1，R2=0.999 5.

1.3.2 超声辅助单因素试验

分别称取干燥粉碎后的银杏叶1 g，超声功率150 W.

1)在室温条件下，乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，超声提取30 min，考察乙醇体积分数对银杏叶浸膏得率的影响.

2)在乙醇体积分数为50%的条件下，将提取时间设定为20、30、40、50、60 min，考察超声时间对银杏叶浸膏提取得率的影响.

3)在乙醇质量数为50%，提取时间为40 min的条件下，设定固液比(g∶mL)分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，考察固液比对于银杏叶浸膏提取得率的影响.

1.3.3 Box-Behnken响应面试验

根据Box-Behnken星点响应面试验设计原理，以浸膏得率为响应值，优化乙醇体积分数、提取时间、固液比.水平试验设计见表1.

表1 响应面试验设计

2 结果与讨论

2.1 单因素对银杏叶浸膏得率的影响

2.1.1 乙醇体积分数的影响

乙醇体积分数对银杏叶浸膏得率的影响见图1.由图1可知：浸膏得率随乙醇体积分数的增大呈先升后降的趋势，在乙醇体积分数为50%时浸膏得率达到峰值，为24.38%.之后，随着乙醇体积分数的继续增加，浸膏得率先下降后再次上升，在乙醇体积分数为80%时，浸膏得率为23.50%，再次达到顶点，此后浸膏得率随乙醇体积分数的继续升高迅速下降.比较乙醇体积分数为50%和80%时的浸膏得率，选定最佳乙醇体积分数为50%.

2.1.2 提取时间的影响

提取时间对浸膏得率的影响见图2.由图2可知：银杏叶浸膏提取得率随着提取时间的增加呈递增趋势，在提取时间为40 min时，银杏叶浸膏提取得率达到最大；提取时间在40～60 min时，提取得率呈现略有下降的趋势.因此，确定最佳提取时间为40 min.

2.1.3 固液比的影响

固液比对浸膏得率的影响见图3.由图3可知：浸膏得率在固液比为1∶40前随着固液比的提高逐渐升高，在固液比为1∶40(g∶mL)时达到最高；之后，随固液比的提高，得率缓慢下降.分析原因，可能是固液比增大，导致溶液浓缩时间延长，浸膏得率下降.因此，确定最佳固液比为1∶40(g∶mL).

图3 固液比对浸膏得率的影响

2.2 Box-Behnken试验结果及分析

2.2.1 Box-Behnken试验结果

响应面试验共设计19个试验点，选择乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、固液比(C)3个因素，试验设计及结果见表2.通过分析得到多元二次回归方程，其回归模型为

表2 响应面试验设计及结果

y=24.48-0.075A+0.18B+0.40C+0.062AB+0.51AC+0.073BC-2.10A2-1.17B2-0.77C2.

表2(续)

回归模型方差分析结果见表3.由表3可知：以银杏叶浸膏含量为响应值时，模型P<0.000 1，说明该回归方程拟合度较好且具有统计学意义.模型失拟项P为0.608 0，大于0.050 0，表明差异不显著，说明未知因素对试验结果干扰很小，该模型能充分反映实际情况[15].确定系数R2为0.997 1，说明99.71%的数据可用此方程解释.各因素对浸膏提取得率的影响依次为固液比(C)>提取时间(B) >乙醇体积分数(A)，交互项AC为模型中的显著因素.

表3 回归模型方差分析

2.2.2 响应面分析

利用响应面分析图可以评价试验因素两两之间的交互作用.通过 Box-Behnken试验得到的响应面图形见图4～图6.响应面图形是在其他试验条件、环境等因素固定的情况下，考察交互项对银杏叶浸膏得率的影响，当等高线呈现近似圆形时，表示两因素之间的交互作用不显著；当等高线呈现椭圆形时，表示两因素之间的交互作用显著[16].由图4、6可知：乙醇体积分数和提取时间、提取时间和固液比交互项的等高线图均近似为圆形，说明交互项的交互作用均不显著；由图5可见：乙醇体积分数与固液比的等高线图呈现椭圆形，说明乙醇体积分数与固液比的交互作用显著，这一结果与表3结果一致.

图4 乙醇体积分数和提取时间的曲面和等高线

图5 乙醇体积分数和固液比的曲面和等高线

图6 提取时间和固液比的曲面和等高线

2.3 验证试验

依据研究结果可知：银杏叶浸膏提取最佳条件为乙醇体积分数50.15%，提取时间40.85 min，固液比1∶42.66(g∶mL)，在此条件下的浸膏得率预测值可达24.5%.结合实验室实际条件及试验可操作性，对银杏叶浸膏得率进行验证.将提取条件修正为乙醇体积分数50%，提取时间41 min，固液比1∶43(g∶mL)，进行3次平行试验，浸膏得率分别为24.8%、24.9%、25.0%，验证试验浸膏提取得率平均值为24.9%，达到了星点响应面法回归模型预测值的101.6%，由此说明，该模型能够较好地模拟和预测银杏叶浸膏得率.

3 结 论

本研究以银杏叶为对象，在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken星点响应面分析法优化超声辅助溶剂萃取银杏叶浸膏的提取工艺.结果表明：在乙醇体积分数为50%，提取时间为41 min，固液比为1∶43 (g∶mL)条件下，银杏叶浸膏得率最高，可达到24.9%.传统的银杏叶浸膏提取工艺在乙醇体积分数为50%微沸的情况下，浸膏得率为19.0%，黄酮含量2.5%；通过对银杏叶浸膏提取工艺优化，在乙醇体积分数为50%的情况下，显著提高了银杏叶浸膏得率(24.9%)及银杏叶中黄酮含量(3.5%).

响应面法研究结果显示：固液比和乙醇体积分数交互项对银杏叶浸膏得率的影响非常显著，这说明乙醇体积分数在银杏叶浸膏提取中起到了非常重要的作用，可能是过高的乙醇体积分数导致物质析出，进而影响得率.同时，我们也发现，在银杏叶浸膏提取工艺的3个影响因素中，固液比对银杏叶浸膏得率的影响最大，其次是提取时间和乙醇体积分数，可能的原因是超声波能有效破坏植物细胞壁，快速萃取生物有效成分，随着固液比增大，生物有效成分能快速溶出；但在固液比高于1∶40(g∶mL)以后，浸膏得率会随固液比的提高缓慢下降，其原因可能是由于固液比增大，导致溶液浓缩时间延长，浸膏提取得率受到影响.

综上所述，在银杏叶浸膏提取过程中，要特别注意控制乙醇体积分数和固液比，这两个因素对浸膏得率影响很大.本研究通过响应面法对银杏叶浸膏提工艺进行优化，可以有效提高银杏叶浸膏及有效成分的提取率，这对于银杏叶的进一步综合利用具有重要意义.银杏叶浸膏中含多种有效药物成分，具有多方面的药理和临床作用，随着药物开发“绿色浪潮”的到来[17]，开发利用银杏叶等自然植物将成为趋势.