两株重组大肠杆菌高密度发酵裂解液澄清工艺研究

任培森，吕文静，郑新勇，刘海霞，王艳晓，朱秀同

（天津瑞普生物技术股份有限公司，天津 300381）

猪 链 球 菌（Streptococcus suis，SS）[1]和 副 猪 嗜 血 杆 菌（Haemophilus parasuis，HPS）[2]是当前猪场最易见的细菌性疾病病原，给养猪业带来了巨大损失。SS则可以分为1-34和1/2 共35 种血清型[3]，而HPS 可以分为1-15 个血清型[4]，二者经常混发，主要造成猪的多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎、心内膜炎、细菌性败血症及支气管炎等[5，6]。

猪链球菌和副猪嗜血杆菌由于血清型众多，不同血清型之间的交叉保护性弱，使用抗生素进行治疗会产生耐药性明显上升[7，8]，影响治疗效果。疫苗成为预防SS 和HPS 有效手段之一，疫苗种类有灭活疫苗、弱毒疫苗、活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗，但市面上主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，其免疫保护力好，但是交叉保护力不明显。而亚单位疫苗是预防猪链球菌新型疫苗[9]，是一种交叉保护力强、价格低廉的急需开发的新型疫苗。猪链球菌、副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的研发，为解决困扰我国养猪业的猪链球菌和副猪嗜血杆菌的防控难题提供完美解决方案。

猪链球菌、副猪嗜血杆菌亚单位疫苗采用重组大肠杆菌高密度发酵，菌体裂解液的澄清对目标蛋白的收率影响巨大，但鲜有相关文献报道。如何实现发酵与纯化中间过程的澄清步骤，是一项重要工作[10]。本文以重组大肠杆菌BL21-HP1036、BL21-palA 高密度发酵为对象，研究如何高效降低澄清液浊度，提高蛋白得率，为猪链球菌亚单位疫苗发酵工艺实现产业化破碎澄清工艺提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

猪链球菌与副猪嗜血杆菌菌株BL21-HP1036、BL21-palA由华中农业大学微生物国家重点实验室提供。

1.1.2 主要培养基及试剂

酵母浸出物和蛋白胨购自英国OXOID公司；氯化钠购自国药集团；琼脂粉购自美国BD 公司；卡那霉素、IPTG 购自北京博奥拓达公司；甲醛购自北京益利公司；SDS-PAGE 凝胶试剂盒购自赛默飞世尔科技公司。

1.1.3 主要试验用设备

高密度发酵罐购自上海百伦生物科技有限公司；高速离心机购湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；电泳仪购自北京六一仪器；紫外凝胶成像系统购自上海嘉鹏科技有限公司；超声波破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；小型高速离心机购自赛默飞世尔科技公司；紫外分光光度计购自美国BIRAD 公司；恒温摇床购自上海苏坤有限公司；亲和层析设备购自荣捷生物工程（苏州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高密度发酵培养菌

将鉴定合格的重组大肠菌BL21-HP1036 株和BL21-palA 株二级种子菌液按2%（V/V）分别接种于合成培养基进行培养，37℃培养35～40 h。

1.2.2 重组蛋白诱导表达

发酵液OD600=40±0.1 时，开始诱导，诱导温度为35℃±0.5℃，诱导10 h结束培养。

1.2.3 高压均质破碎与离心

灭活检验合格的菌液采用高压均质机破碎分别进行菌体裂解，压力100～150 MPa，破碎完成后将破碎液低温保存。

上清液获得：用高速离心机离心，离心转速：15 000 rpm，温度控制：10℃～15℃，进样速度：0.5～1 L/min 分别收集上清，上清液用去除内毒素的容器进行装盛。

1.2.4 微滤膜包澄清

将膜包用10 L 的纯化水单向冲洗，进行切向流过滤。取管线离心机离心后的破碎菌悬液300 mL，利用0.45 μm 微滤膜包进行澄清，分别取样测浊度，对比离心后浊度、微滤膜包澄清液浊度、微滤膜包浓缩液上清浊度，并对样品层析及电泳检测蛋白含量，评估蛋白得率，利用两步法来进行澄清。

2 结果

2.1 BL21-HP1036和BL21-palA蛋白澄清数据与试验结果

图1 结果表明，经过管式离心方法，BL21-HP1036 和BL21-palA 重组大肠杆菌破碎液浊度分别由4 500 NTU 和4 000 NTU 降低至1970 NTU 和520 NTU；而经过微滤膜包方法，BL21-HP1036 和BL21-palA 重组大肠杆菌破碎液浊度降低至25 NTU 和1.28 NTU。由此可见，采用微滤膜包切向流过滤，优化开放式流道，比传统的离心机过滤澄清效果在降低内毒素、降低层析料液粘稠度及浊度有着良好的效果，可显著降低破碎重组大肠杆菌的杂蛋白及核酸。

图1 BL21-HP1036和BL21-palA重组大肠杆菌澄清工艺浊度Fig.1 The turbidity of BL21-HP1036 and BL21 palA recombinant escherichia coli clarification process

2.2 BL21-HP1036和BL21-palA样品蛋白回收率

由表1、图3 来看重组大肠杆菌BL21-HP1036 蛋白在微滤渗出澄清液和微滤膜包浓缩液上清均存在，将微滤渗出澄清液和浓缩液上清中的蛋白回收后蛋白总收率约为88.5%；BL21-palA蛋白同样存在于微滤渗出澄清液和微滤膜包浓缩液上清，蛋白总收率是81.5%。

表1 BL21-HP1036和BL21-palA二步法澄清蛋白回收率Tab.1 The BL21-HP1036 and BL21 palA two-step clarified protein recovery

图2 BL21-HP1036、BL21-palA SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.2 The BL21-HP1036 and BL21 palA SDS polyacrylamide gel electrophoresis

3 结论

本文中分别表达猪链球菌和副猪嗜血杆菌关键基因BL21-HP1036 与BL21-palA 的菌株经过高密度发酵，通过0.45 μm 微滤膜包澄清工艺，显著降低料液的浊度，表明采用微滤膜包切向流过滤技术澄清破碎大肠杆菌，比高速离心机离心澄清效果较好，可显著降低破碎重组大肠杆菌的杂蛋白及核酸。 单独微滤膜包收集清夜后，有62.9% 的BL21-HP1036目标蛋白在微滤渗出澄清液中，37.1% 为微滤浓缩液或者存在于微滤膜包内及其他损失，故采用两步法澄清，第一步用0.45μm 微滤膜包进行澄清收集渗出液，第二步将剩余在浓缩液进行管式离心后收集上清，两步澄清液合并作为层析样品，其浊度值不会明显上升，蛋白得率可达85.5% 以上，BL21-palA 发酵液，经过二步法处理蛋白收率可达到81.5%。

本研究表明二步法澄清工艺可以有效解决澄清难题，有效降低层析干扰，降低层析填料负荷、提高目标蛋白回收率、提升工作效率，具有实际应用价值。