二硫苏糖醇保护-改进的QuEChERS吸附剂净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定丹参中30种农药的残留量

唐玉菲,王 雷,杨成伟,刘必勇

(安徽省第二人民医院 职业卫生实验室,合肥 230022)

丹参作为一种中药材,有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痛等效用,在临床中应用广泛。在丹参大规模人工种植中会施用农药来保障其产量与质量,而栽培过程中的不合理用药,会引起药材中部分农药残留超标的问题,这不仅直接影响丹参药材的安全性和有效性,还会给人类的生命健康带来潜在威胁[1]。为了保障丹参药材的质量,有必要对丹参中农药的残留水平进行监测。

在多组分农药残留的检测方法中,气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)具有灵敏度高、选择性好、通量高等优点,是目前主要的农药残留检测方法[2-3]。测定前,样品前处理方法的选择也很重要,其中Qu ECh ERS是一种基于固相萃取和基质固相分散技术于一身的方法,具有经济高效、简单稳定的特点,在水果、蔬菜的多农药残留检测方面应用广泛[4-9]。Qu ECh ERS在中药材检测中的应用也有报道,但由于中药材种类繁多且基质复杂,在采用Qu ECh ERS提取净化时,需要根据样品基质和目标组分的性质选用合适的吸附剂[10-12]。文献[4]以QuECh ERS提取,分散固相萃取法净化,LC-MS/MS测定丹参中农药的残留量[13],但该方法未涉及内吸磷、杀虫脒等《中华人民共和国药典》(2020年版)第五法规定的检测项目。文献[14]以石墨化碳黑(GCB)作吸附剂,结果显示,中药材丹参中有机磷类和磺隆类农药回收率偏低,推测和这两类农药易被GCB吸附、难以洗脱有关。

本研究团队发现,使用传统的含有GCB 的Qu ECh ERS吸附剂净化丹参药材时,不仅存在上述部分农药难以洗脱的现象,还存在内吸磷、甲拌磷砜等降解导致回收率偏低的现象。二硫苏糖醇是一种具有线性分子结构的有机还原剂,氧化后会形成稳定的氧化态六元环,常作为还原剂或保护剂应用于环境或医学领域[15-16]。鉴于此,本工作以1.0 mol·L-1二硫苏糖醇溶液作保护剂,以不添加GCB 的Qu ECh ERS吸附剂进行净化,以超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)同时测定丹参中30种农药的残留量,方法操作简便、快捷、灵敏度高、重复性好,适用于丹参中多种残留农药的快速高效的定性与定量分析,在满足农残检测要求的同时避免了部分磺隆类和有机磷类农药在前处理过程中的损失。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 II型超高效液相色谱;6470型三重四极杆质谱仪;SPEX Geno/Grinder 2010-QuEChERs型高通量动植物组织研磨机;ME104E型电子天平;XW-80A 型涡旋仪;N-EVAP型12位氮吹仪;5910R 型高速冷冻离心机。

30种农药混合标准溶液:100 mg·L-1,编号为IST29486。

混合标准储备溶液:1 mg·L-1,由30种农药混合标准溶液用乙腈稀释制得,于4℃冰箱中储存。

基质匹配混合标准溶液系列:配制空白样品溶液6份,分别加入10,20,50,100,150,200μL 混合标准储备溶液,加入150 μL 水,用乙腈定容至1 mL,配制成质量浓度为10,20,50,100,150,200μg·L-1基质匹配混合标准溶液系列。

乙腈、乙酸为色谱纯;甲酸、甲酸铵、二硫苏糖醇、无水硫酸镁、无水硫酸钠均为分析纯;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、硅胶;试验用水为超纯水。

丹参样品购自亳州市某中药材市场。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱(150 mm×3.0 mm,1.8μm);柱温40 ℃;流动相A 为含0.1%(体积分数,下同)甲酸的10 mmol·L-1甲酸铵溶液,B为乙腈;流量0.3 mL·min-1;进样量5μL。梯度洗脱程序:0～1 min,A 为95%;1～4 min,A由95%降至40%;4～14 min,A 由40%降至0,保持4 min;18～20 min,A 由0 升至95%,保持6 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源正离子模式;干燥气温度250℃,流量11 L·min-1;鞘气温度350 ℃,流量12 L·min-1;喷雾压力140 kPa;毛细管电压3 500 V;喷嘴电压500 V;多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表1,其中“*”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

表1 (续)

1.3 试验方法

将样品均匀粉碎,过三号筛[筛网孔径(355±13)μm],转移至干净的样品袋中,于4 ℃冰箱中保存。分取(3±0.05)g样品,置于50 mL聚苯乙烯离心管中,加入1.0 mol·L-1二硫苏糖醇溶液100μL和1%(体积分数,下同)乙酸溶液15 mL,涡旋,使药粉被充分浸润,放置30 min。加入15 mL 乙腈,涡旋混匀,以500 r·min-1转速振荡5 min,加入质量比4∶1 的无水硫酸镁和无水硫酸钠混合粉末7.5 g,立即摇散,以500 r·min-1转速振荡3 min,于冰浴中冷却10 min,以4 000 r·min-1转速离心5 min。分取上清液9 mL,置于预先加好4 种Qu ECh ERS吸附剂(无水硫酸镁900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅胶300 mg)的净化管中,涡旋混匀后置于振荡器上剧烈振荡5 min,以4 000 r·min-1转速离心5 min。分取上清液5 mL于玻璃试管中,于40 ℃氮吹浓缩至约0.4 mL,加入150μL 水,用乙腈定容至1 mL,涡旋混匀后过0.22μm 滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

基质匹配混合标准溶液的色谱图见图1。

图1 基质匹配混合标准溶液的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of the matrix matched mixed standard solution

2.2 提取条件的选择

乙腈作为Qu ECh ERS 最常用的提取溶剂,适用于极性分布较宽的多残留农药组分的同时提取,因此本工作采用乙腈作为提取溶剂。QuEChERS最佳使用环境为弱酸性环境,且大多有机磷类农药在酸性环境中较稳定,因此试验选择在提取前增加乙酸溶液浸泡步骤,并比较了不同体积分数(0.2%,0.5%,1%,2%,3%)乙酸溶液的浸泡效果[17]。结果显示:当乙酸溶液体积分数不大于1%时,提取溶液为浅红色;乙酸溶液体积分数继续增加,提取溶液的颜色随之加深,说明共萃取物色素杂质增多。考虑到基质效应影响,试验选择乙酸溶液的体积分数为1%。

为了提高农药在提取溶剂中的溶解度,试验选择在用乙腈提取时加入质量比4∶1的无水硫酸镁和无水硫酸钠混合粉末,并考察了混合粉末用量(5,7.5,10 g)对加标样品中30种农药回收率的影响。结果显示:回收率随着混合粉末用量的增加而增大,尤其是甲胺磷和涕灭威;当混合粉末的用量不小于7.5 g时,回收率均达到80.0%以上,且基本稳定,说明此时的盐析效果较好。综合考虑,试验选择混合粉末的用量为7.5 g。

2.3 净化条件的选择

分别采用传统QuECh ERS 吸附剂(无水硫酸镁900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅胶300 mg、GCB 90 mg)和去除GCB 后的Qu ECh ERS吸附剂(无水硫酸镁900 mg,PSA 300 mg,C18300 mg、硅胶300 mg)净化加标样品(加标量0.05 mg·kg-1),并比较了其中杀虫脒和磺隆类农药回收率的变化。结果显示:传统吸附剂去除丹参中色素的效果稍好,但是由于GCB对于部分农药有很明显的吸附,氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆和杀虫脒的回收率明显下降,其中杀虫脒的回收率低于50.0%,磺隆类农药的回收率为69.0%～82.0%;而采用去除GCB后的Qu ECh ERS吸附剂净化时,杀虫脒回收率提高至87.2%,磺隆类农药的回收率提高至85.0%～96.0%,且其他农药的回收率没有明显变化。鉴于此,试验选择采用不添加 GCB 的Qu ECh ERS吸附剂净化样品。

2.4 保护剂种类及用量的选择

试验发现,样品溶液在空气中的暴露时间(包括样品前处理时间和前处理后样品溶液放置时间)越长,丹参中部分有机磷类农药回收率越低。如当整个暴露时间达到90 min时,内吸磷、甲拌磷砜、苯线磷的回收率分别为48.0%,70.0%和75.0%,推测丹参提取溶液中这几种有机磷类农药在前处理过程中发生了氧化或降解。鉴于此,试验选择在样品前处理过程中加入一定量的保护剂,如抗坏血酸和二硫苏糖醇等来降低有机磷类农药的降解。当二硫苏糖醇溶液和抗坏血酸溶液的质量浓度均为1.0 mol·L-1时,比较了添加不同抗氧化剂后30种农药的稳定时间。结果显示:添加二硫苏糖醇溶液后,30种农药峰面积在8 h内无明显变化;添加抗坏血酸溶液后,内吸磷的峰面积在4 h后逐渐降低,8 h时后下降了33%。因此,试验选择的保护剂为二硫苏糖醇溶液,并考察了不同二硫苏糖醇溶液用量(0,10,50,100,200μL)对加标样品(加标量0.05 mg·kg-1)中内吸磷、甲拌磷砜、苯线磷回收率的影响,结果见图2。

图2 不同二硫苏糖醇溶液用量下苯线磷、甲拌磷砜、内吸磷的回收率Fig.2 Recoveries of phenophos,phorate sulfone and fenamiphos with different amounts of dithiothreitol solution

由图2 可知:添加了二硫苏糖醇溶液后,内吸磷、甲拌磷砜和苯线磷的回收率有明显的提高,且随着用量的增加而增大,当二硫苏糖醇溶液用量不小于100μL时,回收率较高且保持稳定。因此,试验选择的二硫苏糖醇溶液用量为100μL,并进一步考察了此用量的二硫苏糖醇溶液添加前后加标样品(加标量0.05 mg·kg-1)中30种农药回收率的变化,结果见表2。

表2 添加二硫苏糖醇溶液前后30种农药的回收率Tab.2 Recoveries of the 30 pesticides before and after addition of dithiothreitol solution

由表2可知,添加二硫苏糖醇溶液100μL 后,内吸磷、甲拌磷砜和苯线磷的回收率分别从48.0%,70.0%,75.0%提高至94.3%,95.5%,98.7%,其他农药的回收率并无明显变化,30种农药的回收率为85.8%～108%,说明以二硫苏糖醇溶液作保护剂时方法的准确度较高。

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

为了降低基质效应的影响,以基质匹配法定量。按照试验方法测定基质匹配混合标准溶液系列,以各农药的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,30种农药标准曲线的线性范围为10～150μg·L-1,其他线性参数见表3。

以空白样品溶液加标的方法进行试验,分别以不小于3倍、10倍信噪比对应的质量浓度计算检出限和测定下限,结果见表3。

表3 线性参数、检出限和测定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

表3 (续)

由表3 可知,30 种农药的检出限为0.001～0.005 mg·kg-1,测定下限为0.005～0.020 mg·kg-1。

2.6 精密度和回收试验

按照试验方法对空白样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平均重复测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表4。

由表4 可知,30 种农药的回收率为81.3%～110%,测定值的RSD为1.3%～11%,说明方法的精密度和准确度均较好。

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表4 (续)

2.7 样品分析

按照试验方法分析3批市售丹参样品,仅在一批样品中检出灭线磷,检出量为0.012 mg·kg-1,其他农药均未检出。

本工作在酸性环境中,以乙腈作提取溶剂提取丹参样品中30 种残留农药;以去除了GCB 的QuEChERS吸附剂净化样品溶液,有效降低了丹参中氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆和杀虫脒的吸附损失;以二硫苏糖醇作保护剂,降低了内吸磷、甲拌磷砜和苯线磷的降解损失;以UHPLC-MS/MS测定30种农药的残留量,方法检测对象涵盖了《中华人民共和国药典》(2020年版)第五法中全部农药残留检测项目,检出限、精密度和准确度满足农药残留检测的技术要求,可为中药材丹参中农药残留的快速筛查提供一种高效、可靠的分析手段。