免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法测定双壳贝类中短裸甲藻毒素的含量

2022-08-16倪一平

理化检验-化学分册 2022年8期

朱波,倪一平

(深圳市罗湖区疾病预防控制中心,深圳 518020)

贝类毒素是海洋毒素中对人类健康影响较大的一类毒素,主要由水体中产毒藻类或微生物产生,按照中毒症状可将其分为麻痹性贝类毒素、腹泻性贝类毒素、神经性贝类毒素、记忆缺失性贝类毒素等四大类[1-2]。神经性贝类毒素主要为短凯伦藻产生的短裸甲藻毒素(Pbtx),该毒素可导致鱼类大量死亡,牡蛎、蛤和贻贝等双壳贝类则对其不敏感。对于长期生长在毒藻分布水域中的双壳贝类,虽然其外表呈现完全健康的状态,但体内却在富集毒素,消除半衰期长达数十天甚至数月。Pbtx热稳定性较好,加热、微波等常规加工处理方式无法消除毒素,反而会因处理过程中贝类食物含水量降低而导致毒素浓度水平显著升高。当消费者食用被污染的双壳贝类后,可能产生恶心、呕吐、腹泻、痉挛、支气管收缩、麻痹、昏迷等神经性中毒症状[3-4]。同时,Pbtx能够通过空气传播,被人吸入后,引起气喘、咳嗽等中毒症状[5]。按照基本结构,Pbtx可分为A 型(Pbtx-A)、B型(Pbtx-B)及十几种衍生物,其中Pbtx-B 最常见[6]。Pbtx主要分布在美洲墨西哥湾沿岸和新西兰豪拉基海湾,但目前已有研究表明,其他海域也受到了此毒素的侵扰[7]。联合国粮食及农业组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)、欧盟、加拿大、新西兰、澳大利亚等规定贝类中Pbtx限量为20 MUs/100 g,我国暂无相应限量的规定[8]。因此,有必要对双壳贝类中Pbtx的含量进行监控。

目前,Pbtx 的检测方法主要有小鼠生物测定法[9]、体外分析法(细胞毒性试验[10]、受体结合试验[11])、免疫分析法(放射免疫法[12]、酶联免疫法[13])、液相色谱-串联质谱法[14-15]等。小鼠生物测定法虽然是发展较早、较常用的分析方法,但存在特异性、重现性、灵敏度都很差,耗时长,容易出现假阳性结果等问题。体外分析法和免疫分析法均无法准确定性定量,并且容易受交叉反应的影响,出现假阳性或者假阴性结果。液相色谱-串联质谱法兼具液相色谱法和质谱法的优势,具有灵敏度高、定性定量准确等特点,越来越广泛地被应用在Pbtx 的检测中。在采用该方法测定时,虽然使用了固相萃取[16]、液液萃取[17]等方法净化样品,但仍存在特异性不强、提取效率不佳等问题,降低了方法的应用推广价值。

免疫亲和柱净化技术利用抗原抗体特异性结合,能够在有效富集毒素的同时净化样品,减少了基质干扰,提高了方法灵敏度和准确度,已被应用于生物毒素检测中[18-19]。多反应监测-信息依赖性分析-增强子离子(MRM-IDA-EPI)为超高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱仪的特有扫描模式,能够实现一次采样同时获得两种采集模式下的数据,即在获得MRM 定量结果的同时完成目标物的二级质谱扫描,通过目标物的二级质谱图与标准二级质谱图的比对,完成双重定性,提高定性分析的准确度[20]。本工作采用免疫亲和柱前处理样品,结合MRM-IDA-EPI扫描模式测定双壳贝类中Pbtx-B的含量,可为海产品中Pbtx的食品风险监测评估、养殖海域环境及生物中Pbtx的本地污染调查,以及因食用被毒素污染的贝类而中毒的患者的病因诊断及临床救治提供先进可靠的技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

TripleQuad 5500+型超高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱仪;3-30KS型台式冷冻离心机;Visiprep 型固相萃取装置;Millipore Q 型纯水系统。

标准储备溶液:10 mg·L-1,用甲醇将Pbtx-B标准品0.1 mg完全溶解并定容于10 mL 容量瓶中,于-20 ℃保存。其他标准溶液均由该溶液用甲醇逐级稀释制得。

磷酸盐缓冲液(PBS):pH 7.3,取十二水合磷酸氢二钠6.45 g、二水合磷酸二氢钠1.09 g、氯化钠4.25 g,用水溶解并定容于500 mL容量瓶中。

Pbtx-B标准品的纯度为95%;甲醇、甲酸、甲酸铵均为色谱纯;十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠均为分析纯;试验用水为超纯水。

试验样品均随机购自当地某水产市场,包括扇贝、贻贝、牡蛎、带子、青口、马刀贝等水产品,分析前于-20 ℃冷冻保存。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Poroshell 120 EC-C18色谱柱(100 mm ×2.1 mm,2.7μm);柱温40℃;进样量10μL;流动相A 为10 mmol·L-1甲酸铵-0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B为甲醇;流量0.3 mL·min-1。梯度洗脱程序:0～1.0 min时,A 为80%;1.0～4.0 min时,A 由80%降至10%,保持5.0 min;9.0～9.1 min时,A 由10%跳转至80%,保持2.9 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源正离子(ESI+)模式;离子化电压5 500 V;离子源温度550 ℃;气帘气压力241 k Pa,喷雾气压力379 kPa,辅助加热气压力379 k Pa;接口加热功能为开启;碰撞气压力模式为高模式;入口电压10 V,出口电压10 V;MRM-IDA-EPI扫描模式。IDA 参数:动态背景扣除;MRM 信号触发EPI阈值500 cps。EPI参数:碰撞能量35 e V;扩展能量15 eV。Pbtx-B母离子质荷比(m/z)895.5;去簇电压80 V;特征子离子m/z859.6,877.5(定量离子),碰撞能量分别为26,33 eV。

1.3 试验方法

取1.0 g(精确至0.001 g)充分匀质的样品于离心管中,加入80%(体积分数,下同)甲醇溶液4 mL,涡旋2 min后超声提取10 min。以8 000 r·min-1转速于4 ℃冷冻离心5 min,上清液转移至另一个洁净的离心管中,重复提取一次。合并上清液,用80%甲醇溶液稀释至10 mL,充分混匀。分取5 mL,加入20 mL PBS,涡旋混匀,待净化。以保存液活化神经性贝类毒素免疫亲和柱,将待测液过柱,用20%(体积分数)甲醇溶液3 mL 淋洗,待淋洗液流干后,适当加压彻底排干柱内残留液体,加入甲醇3 mL洗脱,过程中确保温度为室温,过柱速率为2～3 mL·min-1。收集洗脱液,并完全混匀,分取1.0～1.5 mL 置于离心管中,用10 000 r·min-1转速离心10 min,上清液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 免疫亲和柱的使用效果

为了验证免疫亲和柱的使用效果,分别进行了回收试验和基质效应试验。在80%甲醇溶液5 mL中加入适量标准溶液,使Pbtx-B 加标量达到50μg·L-1,充分混匀后加入20 mL PBS,按照试验方法测定,所得Pbtx-B 的回收率大于80.0%,准确度满足试验需求。分别以空白基质溶液和甲醇配制100μg·L-1标准溶液,按照仪器工作条件测定,以二者峰面积的比值计算基质效应值,所得结果为98.8%,说明采用免疫亲和柱净化样品可有效降低基质效应。

2.2 色谱条件的选择

结合Pbtx-B亲脂的性质,常规C18色谱柱即可满足分离需求,同时对梯度洗脱程序、流量、柱温等色谱条件进行优化,所得参数见1.2.1节。在此条件下,目标物色谱峰峰形尖锐、对称,基线平稳,目标物在7 min内即可得到较好分离。

2.3 质谱条件的选择

根据Pbtx-B分子结构,选择在ESI+模式下检测,采用针泵进样,在确定母离子和子离子的m/z后分别优化去簇电压和碰撞能量等质谱参数,使Pbtx-B的响应信号最大,得到MRM 模式下Pbtx-B的总离子流色谱图,结果见图1。

图1 Pbtx-B的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of Pbtx-B

在MRM 采集条件的基础上建立MRM-IDAEPI扫描模式,用标准物质获得Pbtx-B的标准二级质谱图并加入谱库。根据Pbtx-B 的响应值合理设定IDA 中信号强度阈值,当样品中可疑色谱峰的响应值超过设置的IDA 阈值时,质谱在1 ms内自动将Q3切换为线性离子阱,并对该MRM 通道的母离子执行EPI,在低(20 eV)、中(35 eV)、高(50 e V)碰撞能量下分别扫描碎片离子,3个碰撞能量所得的碎片离子混合图即为二级质谱图。软件在谱库中搜索对应的标准二级质谱图,并自动计算二者的相似程度百分比,结合常规方法学验证,从而实现对目标物的定性确证。

2.4 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件测定质量浓度分别为5,10,20,50,200,500μg·L-1的标准溶液系列,以Pbtx-B的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,Pbtx-B标准曲线的线性范围为5～500μg·L-1,线性回归方程为y＝2.145×103x-9.738×103,相关系数为0.996 8。

按照试验方法制备并测定加标空白样品溶液,以3倍信噪比(S/N)对应的质量浓度计算检出限(3S/N),结果为30μg·kg-1。