仙灵骨葆胶囊TLC鉴别方法研究

祝清灿 徐 东 汪 娥 孙宜春* 段 丽 李慧馨 胡 晓

1.国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，贵州 贵阳 550026；2.中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 201203

仙灵骨葆胶囊收载于《国家中成药标准汇编》骨伤科分册，由淫羊藿、续断等6味中药组成，具有滋补肝肾、接骨续筋、强身健骨的功效。用于骨质疏松和骨质疏松症、骨折、骨关节炎、骨无菌性坏死等[1]。近年来，国内外对仙灵骨葆胶囊药理活性和临床应用的研究成果不断涌现，但对质量标准的研究较少，现行质量标准[WS-10269(ZD-0269)-2002-2011Z]中，仅对淫羊藿、丹参和补骨脂进行薄层色谱鉴别，且淫羊藿的鉴别方法斑点拖尾；补骨脂的鉴别方法主斑点Rf值较低；无续断和知母的薄层鉴别方法。国家中医药管理局将仙灵骨葆胶囊标准列入中药重点产品行业标准制定提升计划，研究根据淫羊藿、续断、丹参、补骨脂和知母的化学成分研究结果[2-6]，对仙灵骨葆胶囊薄层色谱鉴别方法进行了系统地研究，改进了淫羊藿、丹参、补骨脂的薄层鉴别方法，提高了方法专属性，增加了续断和知母的薄层色谱鉴别方法，提高了质量标准的可控性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ML204-102型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；ZF-7N型智能暗箱式三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；KQ-5000A型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；101-2A型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；HH-4型数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)；薄层成像仪(CAMAG Visualizer 2)。

1.2 试药 淫羊藿苷(批号：110737-202017)、川续断皂苷Ⅵ(批号：111685-201908)，丹参酮ⅡA(批号：110766-201721)、异补骨脂素(批号：110738-201614)、知母皂苷BⅡ(批号：111839-201706)对照品，丹参(批号：120923-201615)、补骨脂(批号：121056-201605)、淫羊藿(批号：121632-201502)、续断(批号：121033-201812)、知母(批号：430023-201807)对照药材，均由中国食品药品检定研究院提供。硅胶G预制板(批号：20180801，青岛海洋化工有限公司；批号：1.05626.0001，德国默克公司)。化学试剂均为分析纯；水为纯化水。仙灵骨葆胶囊样品(批号：20180704，20180706，20180708)由国药集团同济堂(贵州)制药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿、续断的鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备 取本品内容物1 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液[7]。

2.1.2 对照药材溶液的制备 分别取淫羊藿对照药材、续断对照药材各0.2 g，照2.1.1供试品溶液的制备方法制备淫羊藿对照药材和续断对照药材溶液。

2.1.3 混合对照品溶液的制备 分别取淫羊藿苷对照品、川续断皂苷Ⅵ对照品，加甲醇制成每1 mL含淫羊藿苷0.2 mg和川续断皂苷Ⅵ 1 mg的混合溶液，作为混合对照品溶液[8]。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按照仙灵骨葆胶囊处方配比，分别取除淫羊藿、续断外的其他处方药味，按照仙灵骨葆胶囊制备工艺制备缺淫羊藿和续断的阴性样品，照2.1.1供试品溶液的制备方法制备缺淫羊藿和续断的阴性对照溶液。

2.1.5 薄层鉴别方法及结果 吸取上述溶液各2～5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条带状(8 mm)，以三氯甲烷-甲醇-水(8∶3∶1.5)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在105 ℃加热，置紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与淫羊藿对照药材和淫羊藿苷对照品色谱相应的位置上，显绿色的荧光条带[9]。再喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至条带显色清晰，在日光下检视。供试品色谱中，在与续断对照药材和川续断皂苷Ⅵ对照品色谱相应的位置上，显相同的棕色条带。如图1所示。

紫外光灯(365 nm)下检视 日光下检视

2.2 丹参、补骨脂的鉴别

2.2.1 供试品溶液的制备 取本品内容物4 g，置具塞锥形瓶中，加乙醚50 mL，超声处理5 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作为供试品溶液[10-11]。

2.2.2 对照药材溶液的制备 取丹参对照药材1 g，照2.2.1供试品溶液的制备方法制备丹参对照药材溶液。再取补骨脂对照药材0.2 g，加乙酸乙酯20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作为补骨脂对照药材溶液。

2.2.3 混合对照品溶液的制备 分别取丹参酮ⅡA、异补骨脂素对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含丹参酮ⅡA 0.5 mg、异补骨脂素0.2 mg的混合溶液，作为混合对照品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按照仙灵骨葆胶囊处方配比，分别取除丹参、补骨脂外的其他处方药味，按照仙灵骨葆胶囊制备工艺制备缺丹参和补骨脂的阴性样品，照2.2.1供试品溶液的制备方法制备缺丹参和补骨脂的阴性对照溶液。

2.2.5 薄层鉴别方法及结果 吸取上述溶液各2～5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条带状(8 mm)，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(14∶1∶0.5)为展开剂[12]，展开，取出，晾干，在日光下检视。供试品色谱中，在与丹参对照药材和丹参酮ⅡA对照品色谱相应的位置上，显相同的橙色条带。喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，晾干，置105 ℃下加热，在紫外光灯(365 nm)下放置5 min左右检视。供试品色谱中，在与补骨脂对照药材和异补骨脂素对照品色谱相应的位置上，显相同的天蓝色荧光条带。如图2所示。

日光下检视 紫外光灯(365 nm)下检视

2.3 知母的鉴别

2.3.1 供试品溶液的制备 取本品内容物3 g，置具塞锥形瓶中，加50 mL甲醇，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次15 mL，弃去乙酸乙酯层，合并水层，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤4次，每次20 mL，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[13]。

2.3.2 对照药材溶液的制备 取知母对照药材0.2 g，照2.3.1供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。

2.3.3 对照品溶液的制备 取知母皂苷BⅡ对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。

2.3.4 阴性对照溶液的制备 照仙灵骨葆胶囊处方配比，分别取除知母外的其他处方药味，按仙灵骨葆胶囊制备工艺制成不含知母的阴性样品。照2.3.1供试品溶液的制备方法制备知母阴性对照品溶液。

2.3.5 薄层鉴别方法及结果 吸取供试品溶液3～7 μL、对照药材溶液5 μL、对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条带状(6 mm)，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(7∶3.5∶1.0∶0.5)的下层溶液为展开剂[14]，展开，取出，晾干，再以正丁醇-甲酸-三氯甲烷(4∶0.5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液-乙醇(1∶6)的混合溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与知母皂苷BⅡ对照品和知母对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。如图3所示

1～2.知母皂苷BⅡ对照品；3.知母对照药材；4～10、13～18.供试品；11～12.知母阴性对照品

3 讨论

3.1 供试品溶液制备 根据化学成分的溶解性，分别对提取溶剂(甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水)，萃取溶剂(乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇)，超声提取时间(10 min、20 min、30 min)，样品取样量(0.5 g、1 g、3 g、5 g、7 g)、加入溶剂量(10 mL、30 mL、50 mL)等条件进行考察，结果表明，以本文中制备方法制备的供试品溶液鉴别斑点最清晰。

3.2 色谱条件考察 根据展开样品主要化学成分的极性，选择适用性较广的展开剂，对展开系统如：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1.5∶4∶0.7)、水饱和的正丁醇、正己烷-乙酸乙酯-甲酸(3∶1∶0.15)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶2)、三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(6.5∶3.5∶1.5∶0.5)，硅胶板种类(硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板)，点样量(1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、10 μL)，条带点样宽度(5 mm、6 mm、7 mm、8 mm)，薄层板预平衡时间(10 min、20 min、30 min)等进行了考察。结果表明，使用文中所用的色谱条件时，展开效果较好，供试品与对照品及对照药材在不同的检视条件下色谱条带数较多，分离度较好。

3.3 专属性考察 分别吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液、阴性对照品溶液，进行薄层鉴别试验，根据拟鉴别化学成分的化学性质，选用不同的显色剂显色，结果显示，供试品色谱在与对照品相对应位置显相同颜色的荧光条带，在与对照药材色谱相应位置有相同颜色的荧光条带，阴性样品无干扰；在日光下检视，供试品色谱在与对照品色谱相对应位置有相同颜色条斑，在与对照药材色谱相应位置有相同颜色条带斑，阴性对照无干扰，说明方法的专属性较好。

3.4 显色剂的选择 显色的顺序直接影响薄层鉴别的效果。通过对三氯化铝乙醇溶液、硫酸乙醇溶液等多种显色剂和显色条件进行显色研究。结果[15]表明，三氯化铝是一种可逆性的显色剂，喷三氯化铝显色后，被激发的荧光斑点大多数是可逆的，显色检视完毕后，不影响薄层板再喷其他显色剂显色，因此，在进行淫羊藿和续断的鉴别时，先喷3%三氯化铝乙醇溶液进行淫羊藿鉴别，后喷硫酸乙醇溶液进行续断鉴别。

综上，本实验利用薄层色谱鉴别技术，对仙灵骨葆胶囊薄层鉴别方法进行系统研究，根据拟鉴别化学成分的化学性质，选用不同的显色剂显色，在不同的显色条件下分别收集显色信息，从而鉴别不同的药材，优化了淫羊藿、丹参、补骨脂的薄层鉴别方法，增加续断、知母的薄层鉴别方法，实现制备同一供试品，使用同一块薄层板，同时鉴别两种不同的药材，与原标准中的薄层色谱鉴别方法相比，可节省检测时间，提高检测效率。新建的薄层鉴别方法能控制处方中大部分药味，全面地控制产品质量，为该制剂的质量标准提升提供参考。