基于HS-SPME-GC-MS和PCA分析知母及其 制品的挥发性成分

刘天琪，江汉美，田宇，刘金敏

（湖北中医药大学药学院，湖北省药用植物研发中心，湖北武汉 430065）

知母为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloidesBge.）的干燥根茎，别名：兔子油草、大芦水、妈妈草、羊胡子根、地参等，主要产于河北、山西、山东、陕西、甘肃、内蒙古等地。始载于《神农本草经》，其性苦、甘，寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火，滋阴润燥之功效，临床用于外感热病，高热烦渴，肺热燥咳，骨蒸潮热，内热消渴，肠燥便秘等症[1]。现代研究表明，知母含有大量的皂苷类、双苯吡酮类、生物碱类和挥发油类等成分[2]，主要具有抗肿瘤作用、改善老年性痴呆症状、降糖、降脂、抗动脉粥样硬化、抗凝血作用、抗炎和改善骨质疏松症状等作用[3]。知母属于药食同源类药材，常用于药膳，制成汤类，如红枣知母汤、牡蛎知母莲子汤、知母乌鸡汤；制成酒类，如酸枣知母酒、黄柏知母酒，具有广泛的应用前景，汤类多为盐制，酒类多为酒制，且临床上使用的中药知母也多为盐知母和酒知母[4]。挥发性成分是广泛存在于植物中的一类化学成分，多数成分在临床上具有一定的药理作用，但目前国内仅发表少量关于单一的知母药材挥发性成分分析的文献[5,6]，没有关于加入辅料后知母挥发性成分的对比分析。

固相微萃取（SPME）技术作为一项新颖的样品前处理与富集技术，适合易挥发性化合物的检出，且具有操作简单、携带方便、操作费用低廉等优点，被广泛应用于食品挥发性成分分析中[7]。主成分分析法（PCA）可通过对数据降维、变量提取与压缩、确定分类和聚类，从复杂的数据中提取有意义的信息[8,9]。所以本次研究利用HS-SPME-GC-MS和PCA对知母及其两种制品，盐知母和酒知母的挥发性成分来进行分析比较，讨论盐和酒两种辅料对于知母挥发性成分的影响，旨在从挥发性成分的角度为知母的食用和药用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 原料

知母药材（批号：20201117）购于武汉强康大药房，经湖北中医药大学生药教研室鉴定为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloidesBge.）的干燥根茎。取知母片，照盐水炙法炒干，为盐知母；取知母片，加黄酒拌匀，闷润炒干，为酒知母。

1.2 仪器

手动固相微萃取（SPME）进样装置，德国IKA公司；Agilent6890/5973型气相-质谱-计算机联用仪，美国Hewlett-Packard公司；顶空瓶（规格15 mL）；65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取纤维头，美国Supelco公司；ALC-210.2型电子天平，北京赛多利斯天平有限公司d=0.01 g。

1.3 试验方法

1.3.1 顶空固相微萃取条件

取知母样品0.6 g，置于15 mL顶空瓶中，插入装有65 μm PDMS/DVB萃取纤维头的手动进样器，在80 ℃下平衡10 min后，再压缩手柄伸出萃取头萃取30 min，取出，立即插入气相色谱仪进样口（温度230 ℃）解析3 min。知母制品实验条件同上。

1.3.2 GC-MS色谱与质谱条件

GC条件：色谱条件HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：从50 ℃开始，以10 /min℃ 升温至230 ℃；载气：高纯度He（99.99%），柱流速：0.80 mL/min，进样口温度：230 ℃；不分流进样。

MS条件：EI源；离子源温度230 ℃，电离电压70 eV；四级杆温度150 ℃；扫描质量范围35～550m/z。

1.3.3 数据处理

采用峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量，并通过NIST08质谱数据库对所出峰的质谱图进行检索，以鉴定各组分。通过SPSS 21.0软件对知母及其制品的挥发性成分及其含量进行PCA。

2 结果与讨论

2.1 挥发性成分分析

依照上述条件对知母及其制品的挥发性成分进行GC-MS分析，分别得到总离子流图（见图1～3）。分析可知，在知母中鉴定出了28种成分，占挥发性成分总量的78.63%，其中主要为醇类化合物，占知母总挥发性成分的22.76%。在知母中占挥发性成分含量最高的为苯乙醇，占挥发性成分的12.19%，其次主要为冰片（9.53%）、己酸（5.53%）、苯甲醇（5.53%）等。

图1 生知母挥发性成分总离子流图 Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of Anemarrhena asphodeloides

图2 盐知母挥发性成分总离子流图 Fig.2 Total ion flow diagram of volatile components of Anemarrhena asphodeloides

在盐知母中鉴定出了28种成分，占挥发性成分总量的89.49%，其中主要为醇类化合物，占盐知母总挥发性成分的28.85%。盐知母中挥发性成分含量最高的苯乙醇，占挥发性成分9.64%，其次主要为正己醛（8.33%）、己酸（7.80%）、苯甲醇（6.01%）等。

在酒知母中鉴定出了29种成分，占挥发性成分总量的78.4%，其中主要为醇类化合物，占酒知母总挥发性成分的38.71%。酒知母中挥发性成分含量最高的为苯乙醇，占挥发性成分20.36%，其次主要为反-2-壬烯-1-醇（5.75%）、己酸（5.38%）、苯甲醇（4.91%）等。具体信息见表1。

图3 酒知母挥发性成分总离子流图 Fig.3 Total ion flow diagram of volatile components of Anemarrhena asphodeloides

表1 知母及其制品的挥发性成分 Table 1 Volatile components of Anemarrhena asphodeloides and its processed products

续表1

续表1

2.2 挥发性成分种类和相对质量分析

从表2中可以看到知母及其制品中挥发性成分主要是烯类、醇类、醛类。三者的共有挥发性成分有3种，分别为正己醛、苯甲醇、β-石竹烯，共有成分分别占知母、盐知母和酒知母挥发性成分总量的11.21%、18.84%、8.68%，说明生品与制品的主要挥发性成分含量和种类具有较大的差异。知母生品中，醇类化合物占知母挥发性成分的22.76%，经炮制后，盐知母中醇类成分提高到28.85%，酒知母中醇类成分高达38.71%，这可能是由于烯类成分经过氧化反应转变成醇类成分造成的，且知母制品的香气较生品浓，结合它们的香气特征可知醇类成分赋予了知母的特征香气[10]，说明生知母与知母制品的挥发性成分已有所不同。

表2 知母及其制品挥发性成分种类和相对质量分析 Table 2 Analysis of volatile components and relative quality of Anemarrhena asphodeloides and its processed products

2.3 挥发性成分主成分分析

由表1可见，3种剂型的挥发性成分含量数据离散，通过SPSS 21.0软件对知母及其制品的70种挥发性成分及其含量进行PCA，得特征值和贡献率见表3，各成分的主成分特征向量及载荷矩阵见表4。由表3和表4可知，第一主成分的贡献率为63.101%，主要反映的是烷类、酸类、炔类化合物3类成分的变异信息，且第一主成分与烷类和酸类化合物呈正相关关系，与炔类化合物呈负相关关系；第二主成分的贡献率为36.899%，与醛类化合物呈正相关关系，与醇类化合物呈负相关关系，两个主成分的累计贡献率达到100.000%，能反映样品的整体信息。以F1和F2两个新的综合指标来代替原来的7类成分所表达的信息，进行综合评价，得到综合得分值及排序见表5，3种知母的挥发性成分经过主成分分析表现出了明显的差异，第一主成分得分最高的是盐知母，第二主成分得分最高的是生知母，综合评分中盐知母得分最高，其次为生知母和酒知母。

表3 主成分的特征值及其贡献率 Table 3 Eigenvalues and contribution rate of principal components

表4 主成分的特征向量和载荷矩阵 Table 4 Eigenvector and load matrix of principal components

表5 主成分综合得分 Table 5 Comprehensive scores of principal components

2.4 挥发性成分讨论分析

本次实验共鉴定出知母及其制品中70种挥发性成分，其中从生知母中鉴定出28个成分，从盐知母中鉴定出28个成分，从酒知母中鉴定出29个成分，三者的共有挥发性成分有3种，分别为正己醛、苯甲醇、β-石竹烯，说明生品与制品的主要挥发性成分含量和种类具有较大的差异，这种差异使制知母的性味和疗效发生了改变[11]。含量较高的正己醛是一些传统中药材抗炎作用的物质基础，具有一定的抑菌作用[12,13]，知母经盐制后引药下行，可发挥滋肾阴、退虚热功效[14]，如牡蛎知母莲子汤便可治疗心烦意乱和口舌干燥的症状；苯甲醇是知母的主要香气来源[15]，盐制后香气增加，与该成分含量增加有关；β-石竹烯具有强大的抗炎活性，并且具有神经保护作用，对改善老年性痴呆症状有一定的效果[16]。盐制后生成的己酸可以降低胆固醇，具有抑制动脉粥样硬化的作用[17]；柠檬烯能够降脂，具有促胃肠动力作用[18]；α-松油醇具有抗氧化、抗癌、抗惊厥和镇静等方面的作用[19]，这三种化合物均为精油的香气组成成分[20]，对盐知母香气贡献较大。实验结果表明，三种知母中相对含量最高的化合物均为苯乙醇，但含量有所区别，苯乙醇是一种芳香高级醇，因其具有柔和、愉快而持久的香气，广泛存在于各种食品中[21]，也是知母香气的重要来源，其中酒知母的苯乙醇含量最高，酒作为知母常见的制法，可引药上行，加强清上焦热、止咳等作用，如酸枣知母酒可安神催眠，滋阴补血，因此，今后很有必要继续讨论盐和酒两种辅料对于知母的挥发性成分的影响，为知母制作药膳提供理论指导。

3 结论

通过PCA结果可知，盐知母挥发性成分的综合得分最高，生知母和酒知母得分较低。因此，本实验采用HS-SPME-GC-MS技术和PCA对知母及其制品的挥发性成分进行分析鉴定，结果表明盐知母的综合评价最高，这也为《中国药典》收录盐知母作为制品这一规定提供了支持，为知母的日常食用和临床应用提供了一定的科学依据，发挥出药食同源最大的作用。