浙江长兴扬子鳄种群遗传多样性研究

方黎明 付春正 李 慧 邹卫强 任大斌 徐菊敏 韩群花 万秋红 方盛国*

(1.长兴尹家边扬子鳄自然保护区，长兴，313100；2.浙江大学生命科学学院，生命系统稳态与保护教育部重点实验室(浙江大学)，国家濒危野生动植物种质基因保护中心(浙江大学)，杭州，310058)

生物多样性是指地球上生存的所有动物、植物、微生物和这些生物所拥有的所有遗传物质，以及由这些生物构成的生态系统，即由遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性三部分组成，其中遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是自然界中物种或种群内各种不同等位基因的总和，表现为在生物体遗传上的千差万别[1-5]。遗传多样性能够反应物种或种群的遗传变异水平，生物的遗传多样性越高，其对环境的适应能力就越强，生存能力也就越强，因此遗传多样性是衡量物种或种群生存、进化和环境条件适应的关键指标[6-7]。此外，遗传多样性也是保护生物学研究的重要内容之一，它可以在一定范围内决定物种的数量及分布范围，如果缺乏对生物的遗传多样性研究，就无法准确地认识物种种群的地理分布格局、进化历史、适应机理、物种数量增长和灭绝等问题[8-9]。

微卫星标记因多态性丰富、共显性遗传、易于检测且有效性高和重复性好等特点，在分析物种或种群的遗传多样性及系统进化关系中表现出巨大的优势，被认为是研究物种或种群遗传变异的最优分子标记，广泛应用于羊、马、牛、猪和鸡等家畜、家禽的遗传多样性研究[10-18]。此外，微卫星标记检测因对模板DNA要求低，且操作过程简捷、高效和自动化，在对濒危野生动物如扬子鳄(Alligatorsinensis)、东北马鹿(Cervuscanadensis)、朱鹮(Nipponianippon)、大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)、虎(Pantheratigris)、豹猫(Prionailurusbengalensis)、丹顶鹤(Grusjaponensis)、东北梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)和西伯利亚狍(Capreoluspygargus)[19-27]等的保护遗传学研究中，该检测技术的应用越来越广泛。

扬子鳄是中国特有的珍稀濒危物种，属爬行纲(Reptilia)，鳄形目(Crocodylia)，鼍科(Alligatoridae)，短吻鳄属(Alligator)[28-29]。该物种曾广泛分布于我国大部分区域，南起海南儋州，北到新疆呼图壁；西起新疆呼图壁，东至浙江余姚，均有扬子鳄分布[30]。但随着气候变迁、人类对扬子鳄的过度捕杀及人类对扬子鳄栖息环境的破坏，导致扬子鳄分布范围大幅缩小，现今扬子鳄主要分布于浙江长兴和安徽宣城[30-31]。浙江长兴尹家边扬子鳄保护区始建于1979年，最初的种群由11条奠基扬子鳄个体组成，截至2019年9月，该保护区扬子鳄数量已达6 691条[32-33]。浙江长兴尹家边扬子鳄保护区由核心区和野放区两部分组成，核心区为扬子鳄研究繁育中心，即最初建设的扬子鳄保护区所在区域；野放区在“国家Ⅱ期工程”——浙江省扬子鳄放归自然建设项目的资助下于2009年开始建设，2011年完成[32，34]。2012年4月15日，保护区首次从核心区甄选120条扬子鳄放归至野放区，作为野放区的奠基种群[34-35]。自此，保护区每年都从核心区内挑选一定数量的7～8龄的扬子鳄放归至野放区，截至2019年7月，已有960条扬子鳄被放归至野放区[34，36-37]。随着野放区扬子鳄的繁殖，野放区扬子鳄已经繁衍发育成一个数量较大的种群。

已有研究[32，38-40]大多利用微卫星标记对浙江长兴尹家边扬子鳄保护区扬子鳄种群个体进行亲子鉴定，或对保护区扬子鳄种群遗传多样性进行整体性分析，并未对核心区和野放区扬子鳄种群遗传多样性进行单独分析和比较，导致保护区核心区和野放区扬子鳄种群遗传多样性差异研究尚有不足。因此，本研究通过随机采集浙江长兴尹家边扬子鳄保护区核心区和野放区的成年扬子鳄血液样本，利用微卫星标记技术，对核心区和野放区种群进行遗传多样性分析，从而了解核心区和野放区种群的遗传多样性及种群遗传分化情况，为核心区扬子鳄放归至野放区提供分子水平上的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与DNA提取

1.2 微卫星标记及引物信息

13个多态性较高的微卫星标记信息见表1[38-39，43]。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上游引物的5′端进行荧光修饰(FAM、HEX或TAMRA)。

表1 微卫星标记信息

续表1

1.3 PCR扩增及STR扩增产物扫描分析

使用20.0 μL PCR扩增反应体系，包括2×TaqMaster Mix(上海捷瑞生物工程有限公司)10.0 μL，ddH2O 8.0 μL，模板DNA 1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，在各引物对应的退火温度下退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增34个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳(120 V，30 min)检测，将扩增成功的PCR产物送至Invitrogen(上海英俊)生物技术有限公司进行STR扩增产物扫描分析，确定扩增产物片段大小。

1.4 数据统计分析

使用GeneMarker v1.5读取STR扩增产物扫描分析结果，确定微卫星标记片段大小；使用Excel Microsatellite Toolkit version 3.1计算等位基因频率、等位基因大小范围、多态信息含量和数据格式转化；等位基因数量、有效等位基因数量、观测杂合度、期望杂合度、香农信息指数和F-统计值用POPGENE 1.32计算；分子方差分析(AMOVA)、FST矩阵计算和基因流计算由Arlequin 3.5.2.2完成。

2 结果与分析

2.1 等位基因分布及频率

核心区和野放区130条扬子鳄在13个微卫星标记中共检测到31个等位基因，其中含有2个稀有等位基因(基因频率<5.00%[44])。13个微卫星标记在核心区和野放区扬子鳄种群中均表现出多态性，微卫星标记CXA-9、CXA-34、CXA-35、CXA-43和CXA-136均具有3个等位基因，其余8个微卫星标记均具有2个等位基因。核心区和野放区扬子鳄种群在13个微卫星标记上均具有相同的31个等位基因，平均等位基因数量均为2.38个。

13个微卫星标记的等位基因频率在保护区核心区和野放区扬子鳄种群间存在差异。CXA-4微卫星标记的等位基因共有2个，大小分别为123、128 bp，核心区扬子鳄种群基因频率较高的等位基因是128 bp(64.62%)，而野放区为123 bp(52.31%)；CXA-41微卫星标记的等位基因共有2个，大小分别为156、160 bp，核心区扬子鳄种群基因频率较高的等位基因是160 bp(57.69%)，而野放区为156 bp(53.08%)；CXA-43微卫星标记的等位基因共有3个，大小分别为113、117、129 bp，核心区扬子鳄种群基因频率较高的等位基因是为113 bp(56.92%)，而野放区为117 bp(49.23%)。其余10个微卫星标记CXA-6、CXA-9、CXA-34、CXA-35、CXA-37、CXA-39、CXA-135、CXA-136、CXA-138和CXA-142，虽然每个微卫星标记的等位基因在核心区和野放区扬子鳄种群间的基因频率存在差异，但每个微卫星标记的较高基因频率的等位基因是一致的，如CXA-35微卫星标记的等位基因共有3个，大小分别为110、114、118 bp，核心区和野放区扬子鳄种群基因频率较高的等位基因均为114 bp，频率分别为87.69%和90.00%。此外，基因频率<5.00%的等位基因包括微卫星标记CXA-9的117 bp，核心区和野放区扬子鳄种群中该基因的频率分别为3.08%和0.77%；微卫星标记CXA-35的118 bp，核心区和野放区扬子鳄种群该基因的频率分别为3.08%和4.62%(表2)。

表2 核心区和野放区扬子鳄种群13个微卫星标记的等位基因长度和频率

2.2 微卫星标记的遗传多样性

保护区扬子鳄种群中的各遗传多样性参数详见表3。13个微卫星标记的等位基因数量为2或3个，平均等位基因数量为2.38个；有效等位基因数量为1.26～2.59个，平均有效等位基因数量为1.88个，平均等位基因数量与平均有效等位基因数量存在差异。有效等位基因数量最高的微卫星标记是CXA-34，为2.59个；有效等位基因数量最低的微卫星标记是CXA-35，为1.26个。

表3 保护区扬子鳄种群13个微卫星标记的遗传多样性参数

13个微卫星标记的观测杂合度为0.21～0.75，平均观测杂合度为0.50，观测杂合度最高的微卫星标记为CXA-34；观测杂合度最低的微卫星标记为CXA-9和CXA-35。13个微卫星标记的期望杂合度为0.20～0.62，平均期望杂合度为0.45，期望杂合度最高的微卫星标记为CXA-34；期望杂合度最低的微卫星标记为CXA-35。微卫星标记CXA-9和CXA-43的观测杂合度低于其期望杂合度。

13个微卫星标记的多态信息含量为0.19～0.54，平均多态信息含量为0.36，多态信息含量最高的微卫星标记为CXA-34；多态信息含量最低的微卫星标记为CXA-35。微卫星标记CXA-34和CXA-43为高度多态标记(多态信息含量>0.50[16])；微卫星标记CXA-4、CXA-6、CXA-9、CXA-37、CXA-39、CXA-41、CXA-136、CXA-138和CXA-142为中度多态标记(0.25<多态信息含量<0.50[16])；微卫星标记CXA-35和CXA-135为低度多态标记(多态信息含量<0.25[16])。13个微卫星标记的香农信息指数为0.42～1.01，平均香农信息指数为0.68，香农信息指数最高的微卫星标记为CXA-34，最低的为CXA-35。

微卫星标记CXA-34的各遗传多样性参数，包括有效等位基因数量、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量和香农信息指数的数值在13个微卫星标记中均最高，表明该微卫星标记的遗传变异最大，遗传多样性最丰富；相反，微卫星标记CXA-35的各遗传多样性参数在13个微卫星标记中均最低，表明该微卫星标记的遗传变异最小，遗传多样性最匮乏。

2.3 核心区和野放区扬子鳄种群遗传多样性

核心区和野放区扬子鳄种群具有相同的平均等位基因数量，但核心区扬子鳄种群的平均有效等位基因数量高于野放区；核心区扬子鳄种群的平均观测杂合度、平均期望杂合度、平均多态信息含量和平均香农信息指数均高于野放区，表明野放区扬子鳄种群相较于核心区扬子鳄种群的遗传变异少，遗传多样性相对缺乏(表4)。

表4 核心区和野放区扬子鳄种群的遗传多样性参数

2.4 保护区扬子鳄种群的遗传变异与分化

在保护区扬子鳄种群具有的总遗传变异中，有96.83%的遗传变异来源于各种群内个体间的遗传变异，仅有3.17%的遗传变异来源于核心区和野放区种群间的遗传变异，表明保护区种群内的遗传变异主要来源于个体之间的遗传变异，核心区和野放区扬子鳄种群间的遗传变异较少，遗传分化程度较低(表5)。

表5 保护区扬子鳄种群遗传变异的分子方差分析结果

13个微卫星标记在浙江长兴尹家边扬子鳄保护区扬子鳄种群中的FIS值为-0.409 5(CXA-142)～0.289 9(CXA-9)，平均值为-0.153 1，其中只有微卫星标记CXA-9的FIS值为正值，其余12个微卫星标记的FIS值均为负值；13个微卫星标记在保护区扬子鳄种群中的FIT值为-0.387 6(CXA-41)～0.301 4(CXA-9)，平均值为-0.130 0，其中微卫星标记CXA-9和CXA-43的FIT值为正值，其余11个微卫星标记的FIT值均为负值，且13个微卫星标记的FIS值均小于FIT值；13个微卫星标记在保护区扬子鳄种群中的FST值为0.000 2(CXA-37、CXA-39和CXA-136)～0.056 7(CXA-135)，平均值为0.020 0(表6)。

13个微卫星标记在保护区核心区和野放区扬子鳄种群中的FIS值分别为-0.607 3(CXA-142)～0.413 7(CXA-9)和-0.588 4(CXA-34)～0.0851(CXA-35)；13个微卫星标记在保护区核心区和野放区扬子鳄种群中的FIT值与其自身的FIS值相同，且13个微卫星标记在保护区核心区和野放区扬子鳄种群中的FST值均为0(表6)。此外，保护区核心区与野放区的FST值为0.031 7，基因流为7.631 5(表7)，表明保护区核心区和野放区扬子鳄种群的遗传分化程度较低。

表6 13个微卫星标记的F-统计值

表7 核心区和野放区扬子鳄种群间的FST值和基因流

3 讨论

在微卫星标记的等位基因中，若某一等位基因的频率很高，那么该等位基因则很容易遗传给子代；而若某一等位基因的频率<5.00%，则称为稀有等位基因，其在生物种群繁衍过程中，遗传给子代的概率很小，很容易在种群繁衍过程中消失[26，44]。因此，在保护濒危动物种群繁衍过程中所发现的稀有等位基因，也是濒危动物遗传多样性研究的重要内容[26]。本研究中的13个微卫星标记在浙江长兴尹家边扬子鳄保护区扬子鳄种群中共检测到稀有等位基因2个，占所有等位基因的6.45%，分别为微卫星标记CXA-9，长度为117 bp，该基因在核心区和野放区种群中的频率分别为3.08%和0.77%；微卫星标记CXA-35，长度为118 bp，该基因在核心区和野放区种群中的频率分别为3.08%和4.62%。稀有等位基因是生物进化的重要成果，同样也是遗传多样性保护的重要内容，特别是对于像浙江长兴尹家边扬子鳄保护区中人工繁殖的濒危小种群，检测到的2个稀有等位基因很可能是最初扬子鳄种群中相对普遍存在的等位基因，但由于20世纪60年代的气候变迁，人类对扬子鳄的过度捕杀和人类对扬子鳄栖息环境的破坏，造成了扬子鳄种群的遗传瓶颈以及在保护过程中人工选择造成的基因频率下降。因此，为了保护浙江长兴尹家边扬子鳄保护区扬子鳄种群的遗传多样性，这些稀有等位基因更应该得到重视[24，26，45]。在将来的扬子鳄繁育保护过程中，研究人员应该重点关注具有稀有等位基因的扬子鳄个体，如有必要，可对其进行集中饲养繁育，防止稀有等位基因在扬子鳄随机交配繁衍过程中丢失，造成保护区扬子鳄种群遗传多样性的进一步下降。此外，需对保护区扬子鳄种群的遗传多样性进行定时检测，监测核心区和野放区扬子鳄种群内稀有等位基因动态变化情况，如发现其中一个区域的扬子鳄种群稀有等位基因频率快速下降且呈消失趋势，应及时在另一种群内选取合适扬子鳄个体补充至稀有等位基因即将消失的种群内。

衡量微卫星标记多态性的一个重要指标是多态信息含量，当一个标记的多态信息含量>0.50时为高度多态标记；0.25<多态信息含量<0.50时为中度多态标记；多态信息含量<0.25时为低度多态标记[6，46]。此外，微卫星标记的多态信息含量还与该标记的可用性和使用效率相关，微卫星标记的多态信息含量越大，在一个生物种群中该标记的杂合子比例就越大，提供的遗传信息就越多[46]。本研究使用的13个微卫星标记的多态信息含量为0.19～0.54，平均多态信息含量为0.36，其中2个微卫星标记为高度多态标记，9个微卫星标记为中度多态标记，2个微卫星标记为低度多态标记，因此本研究使用的13个微卫星标记可作为研究浙江长兴尹家边扬子鳄保护区扬子鳄种群遗传多样性的有效遗传标记[47]。浙江长兴尹家边扬子鳄保护区野放区扬子鳄种群的平均有效等位基因数量、平均观测杂合度、平均期望杂合度、平均多态信息含量和平均香农信息指数均低于保护区核心区扬子鳄种群，表明保护区野放区扬子鳄种群的遗传多样性相对缺乏。这一结果可能与在野放过程中未对核心区扬子鳄种群、野放区扬子鳄种群以及挑选的野放个体的遗传多样性进行系统性分析有关。

本研究利用13个微卫星标记对浙江长兴尹家边扬子鳄保护区扬子鳄种群进行遗传多样性分析，并比较保护区核心区和野放区扬子鳄种群的遗传多样性差异，了解了浙江长兴尹家边扬子鳄保护区扬子鳄种群在生存和繁衍过程中可能存在低频等位基因丢失的情况。本研究仅检测到2个稀有等位基因，因此在后续的扬子鳄种群保护繁殖过程中，保护区应注重对低频等位基因及稀有等位基因的监测和保护。此外，本研究还发现，虽然2012—2019年保护区核心区扬子鳄种群中已有960条扬子鳄被放归至野放区，但保护区野放区扬子鳄种群的遗传多样性与核心区扬子鳄种群仍存在一定差异[36-37]，野放区扬子鳄种群的平均有效等位基因数量、平均观测杂合度、平均期望杂合度、平均多态信息含量和平均香农信息指数均低于核心区扬子鳄种群，因此在后续的扬子鳄野外放归过程中，保护区应注重分析核心区和野放区扬子鳄种群的遗传多样性，保证保护区扬子鳄种群的遗传多样性不会在野放过程中降低，从核心区扬子鳄种群中挑选出合适的野放个体进行野外放归，从而丰富野放区扬子鳄种群的遗传多样性。